论文部分内容阅读
牛多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，Pm）是一种能引起鸡、鸭、鹅、牛、羊、猪等家禽和家畜患病的革兰氏阴性菌，给养殖业造成了巨大的经济损失。依据荚膜抗原的不同可分为A、B、D、E、F5种荚膜血清型，其中，荚膜血清型A（PmA）主要引起包括牛肺炎在内的呼吸系统疾病，给养殖业带来了巨大的经济损失。 NLRP3炎症小体是一种分子量约为700kDa的多蛋白复合体，能够被多种病原相关分子模式或损伤相关分子模式激活，激活的NLRP3炎症小体复合体通过活化半胱天冬酶-1持续地将pro-IL-1β和pro-IL-18剪切为成熟的IL-1β和IL-18，进而激活下游信号转导通路，产生大量炎性介质，引起机体发生炎症反应。 迄今为止，人们很少对巴氏杆菌的致炎机制进行深入研究，本文通过探究牛源PmA感染小鼠腹腔巨噬细胞后诱导细胞炎症相关的信号通路，为牛多杀性巴氏杆菌致炎机制的研究奠定基础。本实验采用牛源PmA感染小鼠腹腔巨噬细胞，通过Western Blot、ELISA、RT-PCR、IFA等方法检测炎症小体作用下游产物IL-1β、IL-18的变化，其主要目标为： （1）探究牛源PmA是否可以在体外诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生炎症反应； （2）NLRP3炎症小体是否参与炎症反应的诱导； （3）TLR2是否参与炎症信号通路的诱导激活； （4）细胞的吞噬作用和炎性信号通路的关系； （5）作用于炎症反应的信号通路的确定。具体结果如下： 1．牛源PmA诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生炎症反应 为确定牛源PmA感染小鼠腹腔巨噬细胞后是否诱导炎症反应，采用1 MOI牛源PmA感染小鼠腹腔巨噬细胞，24 h后，ELISA检测细胞培养上清中炎性相关的细胞因子IL-1β、IL-18、IL-6、IL-1α、TNF-α、IL-12的分泌情况；同时，Western Blot检测细胞培养上清中成熟IL-1β的分泌情况及细胞裂解液中IL-1β前体的表达情况；RT-PCR检测不同时间点IL-1β、IL-18的转录情况。ELISA结果显示，牛源PmA感染巨噬细胞后，细胞培养上清中炎性相关的细胞因子分泌量都显著增加；Western Blot检测感染后细胞裂解液中IL-1β前体（31 kDa）及培养上清中IL-1β成熟体（17 kDa）的分泌量明显增加；RT-PCR结果显示，IL-1β、IL-18 mRNA在转录水平上随感染时间增加不断上升，说明牛源PmA感染巨噬细胞后引起宿主细胞产生炎症反应。 2．NLRP3炎症小体参与炎症反应的诱导 为检测牛源PmA感染巨噬细胞后是否激活caspase-1，采用1 MOI牛源PmA感染小鼠腹腔巨噬细胞，24 h后，通过免疫荧光检测含成熟caspase-1的阳性细胞数量。结果显示，感染牛源PmA后，大量细胞出现绿色荧光。说明巴氏杆菌感染后引起caspase-1的激活。 为了进一步研究NLRP3炎症小体在牛源PmA感染巨噬细胞后对炎症反应的调节作用，采用1 MOI牛源PmA感染NLRP3炎症小体组成成分基因敲除小鼠腹腔巨噬细胞（即Casp1-/-、Nlrp3-/-、Asc-/-小鼠腹腔巨噬细胞），ELISA检测炎性相关细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α的分泌情况，同时Western Blot和IFA检测感染后IL-1β的分泌情况。结果显示，感染后IL-1β的分泌量在3种基因敲除小鼠腹腔巨噬细胞中显著下降，Casp1-/-及Asc-/-巨噬细胞几乎没有IL-1β的分泌。共同说明牛源PmA感染后，NLRP3炎症小体参与炎性信号通路的诱导，且IL-1β的分泌依赖于caspase-1和ASC。 3.TLR2参与NLRP3炎症小体相关的炎性信号通路的诱导 为了确定TLR2模式识别受体是否参与巴氏杆菌感染后NLRP3炎症小体的激活，通过RT-PCR检测感染后不同时间点TLR2和NLRP3在转录水平上的表达情况。RT-PCR结果显示，感染后TLR2及NLRP3 mRNA的表达量随时间变化显著增加，说明TLR2参与巴氏杆菌感染后NLRP3炎症小体相关的炎性信号通路的激活。 4.吞噬作用参与炎症反应的诱导 为了研究巨噬细胞的吞噬作用对炎症反应的影响，牛源PmA感染后通过不同 时间点定点涂布平板并进行平板菌落计数来确定牛源PmA感染后黏附在细胞表面，进入细胞内以及进入细胞后的存活情况的动态变化。结果发现，27 h内黏附在细胞表面及进入胞内的细菌数量随时间变化呈现出先上升后下降的趋势，且进入细胞内细菌的存活率随时间推移不断降低。但是，当采用细胞松弛素 B破坏细胞的肌动蛋白骨架抑制细胞对细菌的吞噬后，发现IL-1β的分泌量显著降低，证明吞噬作用参与炎症反应的诱导。 5．NF-κB、PI3K、Syk信号通路参与炎性信号通路的调控 为了研究不同的信号通路和炎症反应的关系，采用相应的信号通路抑制剂处理巨噬细胞1 h，再用1 MOI牛源PmA感染细胞，24 h后ELISA检测IL-1β的分泌情况。结果表明，NF-κB、PI3K、Syk信号通路抑制剂处理后，IL-1β的分泌量显著降低，Western Blot结果同ELISA结果一致。充分说明这3条信号通路正调控炎症反应的诱导。