论文部分内容阅读
吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinine,PQQ)是继黄素核苷酸(FMN、FAD)和烟酰胺核苷酸(NAD、NADP)之后发现的第3种辅酶,对微生物和动植物都具有重要生理学功能,并且在食品、医药及农业等领域具有广阔应用前景。以PQQ为辅酶的醌蛋白葡萄糖脱氢酶(PQQGDH)与PQQ结合成具有活性的全酶后便能催化葡萄糖生成葡萄糖酸,而且PQQGDH在氧化葡萄糖过程中不利用氧作为电子受体,因此PQQGDH在检测葡萄糖传感器的应用方面备受关注。
PQQ的生物合成涉及4-7个相关基因,这些基因一般成簇排列。不同来源的PQQ基因具有一定的同源性,并各自组成类似的pqq基因簇。肺炎克雷伯氏菌编码PQQ的基因pqqABCDEF连续排列成1个基因簇,大小约为7K。本课题以肺炎克雷伯氏杆菌肺炎亚种(Klebsiella pneumoniaesubsp.pneumoniae)编码PQQ基因簇作为模板,利用PQQ基因簇本身自带的SalⅠ酶切位点,分成2K、5K两个片段进行分段克隆分段连接,避免了大片段克隆的非特异性,最终构建成pET28a-PQQ质粒,鉴定成功后转化大肠杆菌BL21得到表达PQQ的工程菌。工程菌发酵表达后采用NBT(氧化型)-甘氨酸钾溶液非酶系统测定PQQ含量。实验以大肠杆菌BL21、肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种设为空白对照,工程菌表达出的PQQ含量远高于前两者,证明了pET28a-PQQ／BL21工程菌构建成功,为接下来优化培养条件,提高PQQ产量奠定了基础。
同时,以大肠杆菌BL21基因组为模板,PCR克隆出编码PQQGDH的gcd基因,与pET28a载体连接后构建成质粒pET28a-gcd。鉴定正确后将质粒转化大肠杆菌BL21,得到pET28a-gcd／BL21的工程菌。IPTG诱导表达,经SDS-PAGE检测,结果显示此菌株高效表达了87 kDa的PQQGDH,由于基因来源和宿主属于同一种菌株,避免了因表达系统冲突而影响产量。在培养基中加入葡萄糖,工程菌的生长和PQQGDH表达量有很大提高。另外,在培养基中添加MgCl2后,PQQGDH的表达量又有所提高,将近是空白菌表达量的20倍,证明了金属离子不仅参与PQQ与其醌蛋白结合过程,同时能提高醌蛋白的产量。