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目的:细菌外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)含有大量的细菌性抗原并具有佐剂作用,能够有效地激活免疫系统,被誉为极具潜力的疫苗候选;当前,鲍曼不动杆菌引起的院内感染备受关注,多重耐药鲍曼不动杆菌更被视为“监护室的噩梦”,对住院病人构成极大威胁,也给医院内感染的控制带来了困难。本课题旨在分离鲍曼不动杆菌的OMVs,分析其对在天然和适应性免疫应答中均发挥重要作用的树突状细胞的调节作用,探讨鲍曼不动杆菌OMVs作为疫苗的作用机制及其用于防控鲍曼不动杆菌感染的可能性。方法:(1)鲍曼不动杆菌外膜囊泡的分离提取:常规培养细菌并经差速离心法分离细菌外膜囊泡,通过透射电镜分析、SDS-PAGE凝胶电泳和考马斯亮蓝染色等相关方法进行细菌外膜囊泡鉴定。(2)细菌外膜囊泡刺激浓度的确定:将分离的细菌外膜囊泡进行系列稀释,取不同浓度的外膜囊泡处理髓源性树突状细胞,MTT法检测细胞的存活率,以不影响树突状细胞存活率的最高细菌囊泡用量确定为拟用刺激浓度(10μg/mL)。(3)鲍曼不动杆菌外膜囊泡刺激的髓源树突状细胞功能分析:经确定浓度的(10μg/mL)外膜囊泡处理髓源性树突状细胞后,应用流式细胞术、qRT-PCR和ELISA等技术,分析髓源性树突状细胞的表面标记、细胞因子分泌谱等生物学活性的变化。(4)鲍曼不动杆菌外膜囊泡刺激的髓源树突状细胞对初始T细胞的影响:应用磁珠分选技术分离获得初始T细胞,将其与外膜囊泡处理后的髓源树突状细胞共培养,经流式细胞术检测T细胞的分化状态、ELISA分析共培养上清中分泌的细胞因子;此外,将鲍曼不动杆菌外膜囊泡免疫小鼠,使用流式细胞术分别检测小鼠脾脏内活化树突状细胞和T细胞亚群的比例,并用ELISA检测小鼠血清中特异性抗体和相关细胞因子水平的变化。(5)体内保护性试验:预先建立鲍曼不动杆菌感染的小鼠败血症模型,根据小鼠的生存情况,评估鲍曼不动杆菌外膜囊泡免疫的小鼠对鲍曼不动杆菌感染的保护作用。结果:(1)鲍曼不动杆菌的临床分离菌株能够产生更多的外膜囊泡:本研究以鲍曼不动杆菌的标准菌株(ATCC 19606~T)为对照,分析了鲍曼不动杆菌临床分离株(JU0126)产生外膜囊泡的能力。结果表明,在人工培养基上生长的鲍曼不动杆菌标准菌株和临床分离株均可产生外膜囊泡,但两者外膜囊泡的产生量不同。(2)鲍曼不动杆菌外膜囊泡具有细胞毒性:鲍曼不动杆菌外膜囊泡在低浓度条件下(不超过10μg/mL)对髓源性树突状细胞生存状况的影响较小,而高浓的鲍曼不动杆菌外膜囊泡(超过50μg/mL)对髓源性树突状细胞呈现明显的细胞毒作用。(3)鲍曼不动杆菌外膜囊泡能促进髓源树突状细胞的成熟:10μg/mL外膜囊泡处理髓源性树突状细胞20h后,可以明显增强树突状细胞MHC-II类抗原、CD80和CD86的表达,表明其抗原提呈能力增强。此外,外膜囊泡的刺激还可促进树突状细胞分泌多种细胞因子。(4)鲍曼不动杆菌外膜囊泡可促进Th2细胞分化、增强抗体的产生能力:鲍曼不动杆菌临床分离株(JU0126)的外膜囊泡在体外和体内均能有效地诱导树突状细胞活性,促进初始T细胞向Th2细胞亚群的分化。同时,外膜囊泡免疫的小鼠抗体产生的能力增强。(5)鲍曼不动杆菌外膜囊泡的刺激具有免疫保护作用:预先用JU0126菌株的外膜囊泡免疫的小鼠可对抗鲍曼不动杆菌引起的败血症,明显延长感染小鼠的生存能力,显示明显的免疫保护作用。结论:鲍曼不动杆菌的临床分离株能够产生更多的外膜囊泡,其可促进树突状细胞的抗原提呈能力,介导特异性抗体的产生,进而发挥对抗鲍曼不动杆菌的免疫保护作用。这一作用一方面可能是通过触发了Th2的分化,导致特异性体液免疫功能的上调;另一方面可能是由外膜囊泡刺激的树突状细胞所分泌的相关细胞因子介导的天然免疫应答所致。