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桑椹为桑（Morus alba Linn.）的成熟果穗,是国家卫生部1988年首批公布的医食同源植物品种之一,我国桑椹产量位居世界首位。桑椹属于热性浆果,极不耐贮,易腐烂、变质。桑椹富含糖、酸、维生素、矿物元素,还含有花色苷、酚酸和黄酮等多种活性物质。本文将天然蜂蜜与桑椹结合,酿制营养全面的复合型果酒,不仅符合了酒类行业的发展趋势,而且还将打造出绿色的保健果酒品牌,迎合当今消费及市场需求。目前,我国几乎没有蜂蜜桑椹酒的酿造技术和品质特征方面的系统性研究。本论文以蜂蜜和桑椹为主要原料,应用传统的微生物分离技术,结合生物技术和仪器分析技术,采用理化指标分析结合感官评定技术,对桑椹和桑园土壤中优良酵母菌的分离、筛选和鉴定,蜂蜜桑椹酒酿造酵母菌株的构建,蜂蜜桑椹酒的发酵工艺及澄清条件,蜂蜜桑椹酒的基本化学成分和香气成分分析等方面进行了系统深入的研究。在蜂蜜桑椹酒的专用菌株、发酵工艺及品质特征等方面取得了较大的研究进展。主要研究结果为:1、从成熟桑椹和桑园土壤的富集培养液,以及蜂蜜桑椹汁的自然发酵液中,共分离得到112株酵母菌。经逐级筛选,优选出两株酵母菌,命名为HM和SM。HM分别在酒精浓度16%,SO2浓度250 mg/L,pH2.01时,1d内产气;SM在酒精浓度14%时,1.5d内产气,在SO2浓度200 mg/L时,1d内产气,在pH1.50时,2d内产气。HM和SM发酵蜂蜜桑椹汁,酒精度分别为9.7%,7.0%（V/V）,总酯产量分别为1890.5,2143.8（mg/L）,感官综合得分分别为84.9,83.1（分）,发酵酒具有素雅的桑果香和怡人的酒香,典型性突出。鉴定结果表明,酵母菌HM为酵母属的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisive）,酵母菌SM为有孢圆酵母属的德尔布有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）。2、对原生质体融合的各种技术条件进行了系统研究,结论如下:（1）确定以Y1（n）(单倍体Y1(a12)和HM（n）（单倍体HM（a4））为原生质体融合的两个亲本菌株。确定含2.0mg/mLCuSO4的完全培养基为选择性培养基,在此培养基上,Y1（n）能生长而HM（n）不能生长。（2）原生质体形成和再生条件:将Y1（n）在YEPD中培养4h（28℃和180r/min）后,用含0.1%β-巯基乙醇的预处理剂处理10min（30℃和180r/min）,再用含1.0%蜗牛酶的酶解液处理1.0h（30℃和120r/min）,原生质体形成率达到94.2%,再生率达到27.1%;将HM（n）在YEPD中培养5h（28℃和180r/min）后,用含0.1%β-巯基乙醇的预处理剂处理10min（30℃和180r/min）,再用含1.5%蜗牛酶的酶解液处理1.5h（30℃和120r/min）,原生质体形成率达到95.4%,再生率达到22.2%。在原生质体形成时用0.7mol/LKCl来配制酶解溶液,而在原生质体再生时,用17%蔗糖来配制稀释液和高渗再生培养基。（3）Y1（n）原生质体灭活条件:60℃恒温水浴处理20min,灭活率达到100%。（4）两亲本菌株按1:1比例混合（浓度均为1×107个/mL）,于30℃和180r/min条件下培养15 min,加入促融剂溶液,振荡10 min,再静止10 min,融合率达到4.85×10-6。（5）筛选及鉴定:通过TTC显色法和杜氏管发酵法初步筛选出10株发酵能力较强的融合子;通过酿造酒复筛试验,结合模糊综合评判法优选出F6和F10两株融合子,以F6最佳。细胞的形态、大小、DNA含量和抗药性分析结果表明,融合子F6和F10为两亲本菌株真正的融合子。（6）遗传稳定性检验:融合子F6和F10经连续传代20次后,其主要性能仍然很稳定,没有发生回复突变现象,说明两融合子具有遗传稳定性。（7）通过基本生理特性和发酵性能比较,揭示了融合子和亲本之间的相互关系。3、融合子F6的发酵工艺条件包括:桑椹最佳果胶酶酶解条件为酶解温度35℃,酶用量为每kg桑椹浆添加0.4mL诺维信酸性果胶酶BEC,酶解时间100min,自流汁得率为14.826%。初始糖度以24%（还原糖220 g/L左右）为宦。采用浊汁发酵,在后期通过下胶对原酒进行澄清处理。研究了发酵温度、接种量、初始pH值、SO2添加量和装液量五个因素影响主发酵过程的具体情况;建立了主发酵质量预测模型为Y=88.64936-6.19732X1+1.49109X2+2.88565X3-4.08817X12-2.49718X32+1.62500X1X2+1.37500X2X3（X1-发酵温度,X2-接种量,X3-初始pH值）,优化的主发酵条件为温度23℃,接种量10%（V/V）和pH值3.5。后发酵温度选择10～15℃。澄清试验结果表明,以壳聚糖0.6g/L+PVPP1.0g/L复合的澄清效果最好,透光率达到60.6%,色度值为12.8,澄清处理后的酒样在酒度、糖含量和酸含量上没有变化,酚类物质和蛋白质被澄清剂絮凝去除而减少,提高了蜂蜜桑椹酒的稳定性。4、分别以大十桑棋、红果2号桑椹和红果1号桑椹和农用桑椹为原料,发酵得到四种蜂蜜桑椹酒,分析了它们含有的各种成分。四种酒样在总糖、总酸、pH值、酒度、挥发酸和单宁等成分上差异不大,但蛋白质含量差异较大。各种矿物元素的含量因品种不同而存在一定差异,但均表现出高钾低钠的突出特点,镁元素含量很高,硒元素含量5.0～8.5μg/L。氨基酸总含量和必需氨基酸含量以红果1号桑椹蜂蜜发酵酒最高,而农用桑椹蜂蜜发酵酒最低;必需氨基酸含量占氨基酸总量的比例在四种酒样间差异不明显;从氨基酸种类含量来看,四种酒样在氨基酸组分上的差异显著（p＜0.05）。蜂蜜桑椹酒的总二氧化硫、游离二氧化硫及有害微生物指标的检测结果符合国家发酵酒卫生标准。对蜂蜜桑椹酒中多酚类物质的情况进行了较详细的研究。结果表明,农用桑椹蜂蜜发酵酒的总酚、总黄酮和总花色苷含量最高,而红果1号桑椹蜂蜜发酵酒最低,大十桑椹和红果2号桑椹蜂蜜发酵酒居中。进一步对酒样中7种酚酸和5种黄酮醇进行了分析,建立了高效液相色谱分析方法,采用Agilent Analytical C18色谱柱（250mm×4.6mm,5.0μm）,酚酸测定方法为:流动相为甲醇-甲酸溶液进行梯度洗脱,流速1.0mL/min,柱温30℃,检测波长260nm,进样量20μL:黄酮醇测定方法为:流动相为甲醇-乙酸溶液进行梯度洗脱,流速1.0mL/min,柱温30℃,检测波长360nm,进样量20μL。测定结果表明,蜂蜜桑椹酒中原儿茶酸、槲皮素和桑色素的含量很高,这可能是其区别于其它果酒的重要特征;各种酚酸和黄酮醇类物质在不同酒种之间存在一定程度的差异,以酚酸中的咖啡酸和黄酮醇中的芦丁含量差异最大,这两种物质可能是区别不同酒种的重要依据。5、从大十桑椹、红果2号桑椹、红果1号桑椹和农用桑椹四种果汁中共检出64种挥发性成分,主要成分包括亚油酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、油酸、亚油酸乙酯、亚油酸甲酯、亚麻酸乙酯、油酸甲酯、3-甲基-丁醇、苯乙醇、2,3-丁二醇、己醛、壬醛和3-羟基-2-丁酮等。以四种桑椹为原料,发酵得到四种蜂蜜桑椹酒,从四种原酒中共检出93种挥发性成分,主要成分包括3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丙醇、苯乙醇、2,3-丁二醇、4-羟基苯乙醇、乙酸乙酯、丁二酸单乙酯、乳酸乙酯、油酸甲酯、乙酸、葵酸、辛酸、3-羟基-2-丁酮等;从四种陈酿酒中共检出76种挥发性成分,主要成分包括3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丙醇、苯乙醇、2,3-丁二醇、1,2,3-丁三醇、4-羟基苯乙醇、3-甲基-丁酸乙酯、2-羟基-丙酸乙酯、乙酸乙酯、3-羟基-2-丁酮等。桑椹从果汁经历发酵和陈酿作用,香气成分的种类和相对百分含量变化很大,总体变化趋势为:低级脂肪酸酯上升,高级脂肪酸酯下降;低级脂肪醇上升,高级脂肪醇变化小,芳香醇上升;低级脂肪酸先升后降,高级脂肪酸大幅下降;酮类上升,醛类下降,酚类先升后降。本文首次采用原生质体融合技术,结合模糊综合评判方法,构建得到适合蜂蜜桑椹酒酿造用的新菌株,该菌株发酵性能优良,且遗传稳定性好;首次对不同品种蜂蜜桑椹酒中各种基本化学成分进行了较全面的研究,着重分析了含有的多酚类物质的情况,初步建立了蜂蜜桑椹酒的酚类物质识别因子;首次采用有机溶剂提取、GC-MS定性分析的方法,研究了不同品种的桑椹原料、蜂蜜桑椹发酵原酒和陈酿六个月的酒中香气成分的组成和比例关系,分析了从原料到陈酿酒过程中香气成分的变化规律。