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本课题从Geobacillus属芽孢杆菌中克隆得到三个耐热性转酮酶基因,并将其导入大肠杆菌中进行可溶性表达验证。选取α位无羟基、a位羟基构形分别为R和S构形的三类转酮酶典型的受体底物,借助于高通量的转酮酶酶活测定方法对这三个耐热转酮酶进行底物谱测定,测定结果证实这三个耐热转酮酶同其它来源的转酮酶一样对受体底物的α位羟基具有选择性,即对α位羟基为R构形的受体底物的催化活力比α位羟基为S构形或α位无羟基的受体底物的催化活力高10至40倍。本课题通过比较三个耐热转酮酶的活力,最终选定来自于Geobaicillus stearothermophilus的转酮酶TK456作为研究对象,借助于计算机Pymol软件和PDB及Swiss-mod el网络数据库对其晶体结构进行了模拟。在晶体结构的催化口袋中Asp470与α位羟基为R构形的受体底物的αα位羟基形成氢键,与氢键距离较近的有Leu382、Leu191、Phe435三个氨基酸残基位点。为了改变此耐热转酮酶对a位羟基的选择性,本课题建立了L191、F435、D470/L191、D470/F435的饱和突变库,并通过测序的方法对建立的突变库质量进行了评估。借助于以pH为基础建立的转酮酶高通量酶活测定和筛选方法对饱和突变库用α位羟基为5构形的模式受体底物L-甘油醛和a位无羟基的模式受体底物丙醛同时筛选,共筛选得到了45个阳性突变体。选取a位无羟基的丙醛、丁醛和甲氧基乙醇醛、α位构形分别为R、S构形的D-甘油醛、L-甘油醛、乙醇醛等几种受体底物对筛选得到的45个阳性转酮酶突变体和野生型转酮酶的催化活力和立体选择性进行了测定,其中对a位羟基为S构形的受体底物L-甘油醛和a位没有羟基的模式受体底物丙醛的催化活力最大分别提高约8.5倍和10倍。利用衍生化试剂对45种阳性突变体催化丙醛形成的产物进行衍生化,并借助于手性气相色谱柱对其光学纯度进行测定,筛选出立体选择性较好的两种突变体,Val191/Arg470 f口Leu435/Glu470,二者催化丙醛形成产物的ee值分别为0.81(R)和0.79(S)。最后利用这两种立体选择性较好的突变体催化α位没有羟基的两种底物丙醛、丁醛,进行了生物催化合成,并对其产物结构进行验证,结果表明突变体Val191/Arg470催化这两种底物的得率分别为：34%、53%；突变体Leu435/Glu470催化这两种底物的得率分别为52%、50%。