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嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）可以引起淡水鱼类、贝类,虾类等发生败血症,也可以感染人发生多灶性气单胞菌骨髓炎,此外它还与人类前列腺和溶血性尿毒症综合征有关,是一种典型的人兽鱼共患病病原菌。大多数致病菌需要铁离子来维持生长和生活,缺铁的细菌可以通过高表达铁载体相关蛋白和铁输入途径,从环境中获取铁离子来维持胞内铁离子动态平衡（铁稳态）。在缺铁环境下,细菌会通过调控相关蛋白的表达,抑制铁输出通道,刺激铁输入通道,进而导致胞内相关生物学过程变化。目前,蛋白质组学技术已经相当成熟,使用蛋白质组学技术或者其他组学技术可以用来预测或者表征蛋白及基因的表达水平,使人们更加了解细胞关键代谢途径、小分子运输途径和蛋白质转运等机制。近年来随着科学技术的发展,蛋白质组学进入翻译后修饰（PTMs）的新时代。PTMs通过特异性氨基酸残基的可逆化学修饰在蛋白质活性中起着重要的作用,它还在许多生理活动,例如细菌的生长和代谢过程、抗生素耐药性、外部环境条件的应激和信号转导等过程中起着关键性作用。目前,大约有600多种不同的PTMs被发现,其中与赖氨酸残基相关的酰基化修饰最为常见,例如甲基化、丙二酰化、丁酰化、琥珀酰化、乙酰化等。在原核生物和真核生物中,已经有很多关于PTMs修饰（磷酸化、甲基化等）对生理功能影响的研究,但在铁胁迫下蛋白乙酰化修饰分布及功能相关研究尚未见报道。故本研究提出了以下科学问题:（1）在铁离子限制条件下,细菌全蛋白和赖氨酸乙酰化修饰蛋白中有多少蛋白发生差异表达,且主要集中在那些途径中?（2）蛋白赖氨酸乙酰化修饰在细菌维持胞内铁离子平衡中的作用是什么?基于以上问题,本论文以嗜水气单胞菌ATCC 7966为研究对象,利用非标记定量（LFQ）结合高分辨率质谱仪分析方法,比较对照与在200 μM 2,2’联吡啶（DIP）铁离子螯合剂处理下,每组各3个生物学重复的样品中全细胞蛋白与乙酰化修饰蛋白的表达变化,并利用多种生物信息学方法分析处理数据。首先,质谱原始数据通过MaxQuant软件进行定量与分析;其次,利用GO、KEGG代谢通路、蛋白质相互作用网络（PPI）对变化的全细胞蛋白与乙酰化修饰蛋白进行生物信息学注释比较分析;进一步利用免疫共沉淀与Western blotting技术,结合特异蛋白抗体与特异性抗乙酰化抗体,对蛋白质学结果进行验证;最后,利用乙酰化位点定点突变系列菌株,研究其在铁离子缺乏条件下的生存率,从而了解乙酰化修饰蛋白在铁离子动态平衡机制中的作用。主要研究结果如下:1.本研究首先利用非标记定量（Label-free quantitative,LFQ）结合高分辨质谱分析的定量蛋白质组学技术,分析嗜水气单胞菌ATCC 7966在铁离子限制条件下的细菌全蛋白定量蛋白质组学。共鉴定到1376个蛋白,其中有172个蛋白发生差异表达,包括66个蛋白上调表达蛋白和1 1 1个蛋白下调表达蛋白。生物信息学分析发现,差异表达蛋白参与多种生物过程,如氧化还原、细胞氨基酸代谢、氧化还原酶复合物、高分子复合物和铁硫结合及结构分析活性过程等。此外,KEGG和蛋白相互作用网络分析发现次生代谢物的生物合成、TCA循化、碳代谢、氧化磷酸化代谢途径、抗生素嘌呤代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的生物合成等代谢途径发生显著变化。然后,利用蛋白印迹方法（Western blotting）验证蛋白质组学数据,结果表明外膜蛋白OprM（AOKMB2）、Acriflavin抗性蛋白AcrA（AOKMB4）、溶血素共调节蛋白（AOKJA9）和TonB依赖性铁载体受体蛋白（AOKFG8）蛋白上调表达,而卵黄蛋白（AOKIY3）、丙酮酸激酶蛋白pyk-2（AOkHY7）和分解代谢物基因激活蛋白Crp（AOKGX7）下调表达,这些蛋白的表达趋势均与蛋白质组学的结果一致。2.为研究酰基化修饰对嗜水气单胞菌维持胞内铁离子平衡的影响,本论文结合高亲和纯化和高灵敏质谱技术,对嗜水气单胞菌在铁离子缺乏条件下赖氨酸乙酰化修饰蛋白的变化进行比较。结果共鉴定到941个赖氨酸乙酰化（Kace）修饰蛋白,2810个Kace修饰位点,结果分析显示有1606个（57.1%）差异表达Kace位点,共720个（76.5%）差异表达Kace蛋白,其中50个上调表达蛋白,670个下调表达蛋白。通过生物信息学分析,将乙酰化差异蛋白进行分子功能、细胞组分和生物过程分析,分析结果显示乙酰化修饰蛋白参与细菌不同的代谢途径和蛋白-蛋白相互作用网络。其中上调蛋白主要参与丙酸代谢、丁酸代谢、氧化磷酸化代谢、核黄素代谢、丙氨酸代谢等过程;而下调蛋白主要参与ABC转运、次生代谢物的生物合成以及不同环境中微生物代谢过程等。进一步,利用蛋白印迹和免疫共沉淀（Immunoprecipitation）的方法验证铁离子缺乏条件下乙酰化修饰蛋白质组学结果。6个Kace修饰蛋白得到验证,包括LuxS蛋白（AOKG57）、膜蛋白插入酶YidC（AOKQZ7）、伴侣蛋白 DnaK（AOKMI6）、磷酸乙酰转移酶（AOKGN7）、细胞色素C蛋白（AOKLXO）和铁吸收调节蛋白Fur（AOKIG7）在乙酰化修饰水平上均显著下调表达,但是在蛋白水平上不变。研究结果显示蛋白质中的赖氨酸乙酰化修饰在调节嗜水气单胞菌胞内铁离子动态平衡过程中起着重要的作用。3.进一步以碳源储存调控因子Crp蛋白为例,研究蛋白赖氨酸乙酰化修饰在铁离子缺乏环境中所起的作用。本论文比较了嗜水气单胞菌野生型、Crp敲除菌和赖氨酸修饰位点突变株（103R\Q、133R\Q、155R\Q和191R\Q,K突变为R模拟乙酰化修饰,K突变为Q模拟乙酰化修饰）在铁离子缺乏条件下的生长特性。结果表明,Crp敲除菌的生长速度比野生型慢,R型突变体的生长存活率显著低于Q型突变体,说明嗜水气单胞菌Crp蛋白的乙酰化修饰在铁离子缺乏条件下起着正调控作用。此外,本论文还利用qPCR方法研究crp系列点突变对铁离子缺乏条件下,RNA结合蛋白Hfq和铁摄取调控蛋白Fur转录水平的影响。研究发现,Crp K103与K191位点可能正调控、K133位点可能负调控hfq的转录;K103与K191位点可能正调控、K133与K155位点可能负调控fur的转录。总之,本论文对嗜水气单胞菌在铁离子缺乏条件下细胞全蛋白与乙酰化修饰蛋白的表达变化进行了系统的分析,并通过crp缺失、补救以及系列点突变菌株的功能研究,揭示蛋白乙酰化修饰在维持胞内铁稳态中起重要的功能。