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类黄酮广泛分布于植物界，在植物生长发育、抗病等过程中发挥重要作用，而且可预防癌症、心血管疾病及神经退行性疾病等人类多种慢性病。正因为类黄酮具有广泛的生物活性和药理功能，所以近年来备受重视，成为研究和开发利用的重点。本课题组前期工作明确了黄瓜黑刺中的色素物质主要为单宁和黄酮醇，并证实CsMYB60在类黄酮生物合成的调控中起关键作用。然而，类黄酮在黄瓜各组织中的分布模式，CsMYB60如何调控黄瓜单宁和黄酮醇的合成，以及类黄酮在黄瓜病原菌抗性中的作用，目前尚不明确。因此，本研究旨在解析黄瓜中类黄酮的分布、在病原菌抗性中的作用，及CsMYB60调控黄瓜类黄酮生物合成的分子机理，以期为黄瓜品质及抗病分子设计育种提供理论依据、靶标基因及技术支撑。为达到研究目标，本研究开展了一系列试验，取得的结果如下：
1、通过DMACA染色和高效液相色谱法明确：黑刺黄瓜中，各组织均有单宁和黄酮醇的积累，果刺单宁含量最高，但不同部位黄酮醇种类有所不同。白刺黄瓜的果肉，果皮及种子中亦有微量单宁的积累，其含量远低于黑刺黄瓜，且仅在白刺黄瓜的叶片和花中有黄酮醇的积累。
2、35S:CsMYB60过表达株系与同世代分离出的非转基因株系相比，除果刺变黑之外，单宁及黄酮醇在各组织中的含量显著增加，证实了CsMYB60的关键调控作用；CsMYB60的过表达提高了黄酮醇和单宁合成途径中结构基因（Cs4CL、CsCHS、CsFLS和CsLAR）的转录水平。
3、酵母单杂交表明CsMYB60可以直接结合类黄酮生物合成途径中CsFLS和CsLAR基因的启动子，从而激活其表达，却不直接结合关键酶基因Cs4CL及其他结构基因的启动子。烟草叶片GUS瞬时表达分析显示，CsMYB60显著促进CsFLS和CsLAR的表达。利用酵母单杂交筛选CsFLS和CsLAR启动子上CsMYB60结合的顺式作用元件，在CsFLS启动子上得到1个位点，在CsLAR启动子得到2个位点。EMSA试验证实了CsMYB60与这3个顺式作用元件的结合。
4、CsMYB60可以促进关键基因Cs4CL、CsCHS的表达，但不能直接结合其启动子，说明激活作用是间接的。因此，以CsMYB60作为诱饵蛋白，利用酵母双杂交筛选黄瓜cDNA文库，得到12个与CsMYB60互作的蛋白。其中包括4个多次出现的转录因子（CsMYC1、CsbHLH42、CsWD40、CsTATA-box），BiFC和Pull-down亦证明CsMYB60与这4个转录因子相互作用。而且，CsMYB60可以直接结合到CsbHLH42和CsTATA-box启动子激活其表达，间接激活CsMYC1和CsWD40的表达。
5、酵母单杂交证明CsMYC1、CsWD40、CsbHLH42、CsTATA-box均能直接结合关键基因Cs4CL的启动子，仅有CsTATA-box能直接结合CsCHS启动子。烟草或黄瓜子叶瞬时表达试验表明：这4个蛋白均能一定程度上促进Cs4CL启动子驱动的GUS报告基因的表达，将CsMYB60与它们分别同时注射时，GUS表达有不同程度的增强，并且5个蛋白同时注射到烟草时，可显著增强GUS基因的表达；然而，只有CsTATA-box蛋白可以有效增强CsCHS启动子驱动的GUS的表达。这说明CsMYB60通过其互作蛋白来调控Cs4CL、CsCHS基因的表达，从而促进类黄酮在黄瓜中的积累。
此外，酵母双杂交，BiFC和Pull-down试验还揭示出CsMYC1可以与CsWD40，CsbHLH42以及其自身互作。
6、为了快速探究CsMYC1、CsWD40、CsbHLH42和CsTATA-box的生物学功能，将这4个基因在拟南芥植株中进行过表达。结果表明，35S:CsMYC1和35S:CsbHLH42转基因拟南芥花青苷和单宁的积累量增加，而35S:CsWD40和35S:CsTATA-box转基因拟南芥花青苷和单宁的含量与WT相比均未发生变化。
7、单宁可提高黄瓜的根腐病抗性。儿茶素处理可抑制黄瓜根腐病病原菌的生长。并且，儿茶素处理过的黄瓜幼苗抽提液可以抑制根腐病病原菌的生长，处理的浓度与抑菌效果呈正相关。用不同浓度的儿茶素处理幼苗3天再接种根腐病菌比用水处理再接种病菌的对照表现出明显的抗性。CsMYB60转基因黄瓜幼苗根腐病抗性增强，而且其抽提液可以有效抑制病原菌的生长。
8、为探明黄瓜不积累花青苷的原因，本文还分析了花青苷合成关键酶ANS的序列和基因表达。结果表明，CsANS1只在黄瓜的叶片中有较低表达，其他组织中未检测到其表达。而在黄瓜各组织器官中，均未检测到CsANS2、CsANS3基因表达。与其他植物ANS启动子相比较，黄瓜CsANS1、CsANS2、CsANS3启动子上均缺失光响应元件G-Box。因此，黄瓜ANS基因的表达缺失或表达过低是黄瓜不积累花青苷的一个关键因素。
总之，本研究表明，单宁可以增强黄瓜根腐病抗性；除果刺外，单宁和黄酮醇在黑刺黄瓜其他组织中也普遍积累；CsMYB60可直接激活CsFLS和CsLAR，并直接或间接激活CsMYC1、CsWD40、CsbHLH42和CsTATA-box，同时与这4个蛋白相互作用形成复合体共同调控关键基因Cs4CL的表达，与CsTATA-box互作调控CsCHS的表达，从而调控黄瓜单宁和黄酮醇的合成。
1、通过DMACA染色和高效液相色谱法明确：黑刺黄瓜中，各组织均有单宁和黄酮醇的积累，果刺单宁含量最高，但不同部位黄酮醇种类有所不同。白刺黄瓜的果肉，果皮及种子中亦有微量单宁的积累，其含量远低于黑刺黄瓜，且仅在白刺黄瓜的叶片和花中有黄酮醇的积累。
2、35S:CsMYB60过表达株系与同世代分离出的非转基因株系相比，除果刺变黑之外，单宁及黄酮醇在各组织中的含量显著增加，证实了CsMYB60的关键调控作用；CsMYB60的过表达提高了黄酮醇和单宁合成途径中结构基因（Cs4CL、CsCHS、CsFLS和CsLAR）的转录水平。
3、酵母单杂交表明CsMYB60可以直接结合类黄酮生物合成途径中CsFLS和CsLAR基因的启动子，从而激活其表达，却不直接结合关键酶基因Cs4CL及其他结构基因的启动子。烟草叶片GUS瞬时表达分析显示，CsMYB60显著促进CsFLS和CsLAR的表达。利用酵母单杂交筛选CsFLS和CsLAR启动子上CsMYB60结合的顺式作用元件，在CsFLS启动子上得到1个位点，在CsLAR启动子得到2个位点。EMSA试验证实了CsMYB60与这3个顺式作用元件的结合。
4、CsMYB60可以促进关键基因Cs4CL、CsCHS的表达，但不能直接结合其启动子，说明激活作用是间接的。因此，以CsMYB60作为诱饵蛋白，利用酵母双杂交筛选黄瓜cDNA文库，得到12个与CsMYB60互作的蛋白。其中包括4个多次出现的转录因子（CsMYC1、CsbHLH42、CsWD40、CsTATA-box），BiFC和Pull-down亦证明CsMYB60与这4个转录因子相互作用。而且，CsMYB60可以直接结合到CsbHLH42和CsTATA-box启动子激活其表达，间接激活CsMYC1和CsWD40的表达。
5、酵母单杂交证明CsMYC1、CsWD40、CsbHLH42、CsTATA-box均能直接结合关键基因Cs4CL的启动子，仅有CsTATA-box能直接结合CsCHS启动子。烟草或黄瓜子叶瞬时表达试验表明：这4个蛋白均能一定程度上促进Cs4CL启动子驱动的GUS报告基因的表达，将CsMYB60与它们分别同时注射时，GUS表达有不同程度的增强，并且5个蛋白同时注射到烟草时，可显著增强GUS基因的表达；然而，只有CsTATA-box蛋白可以有效增强CsCHS启动子驱动的GUS的表达。这说明CsMYB60通过其互作蛋白来调控Cs4CL、CsCHS基因的表达，从而促进类黄酮在黄瓜中的积累。
此外，酵母双杂交，BiFC和Pull-down试验还揭示出CsMYC1可以与CsWD40，CsbHLH42以及其自身互作。
6、为了快速探究CsMYC1、CsWD40、CsbHLH42和CsTATA-box的生物学功能，将这4个基因在拟南芥植株中进行过表达。结果表明，35S:CsMYC1和35S:CsbHLH42转基因拟南芥花青苷和单宁的积累量增加，而35S:CsWD40和35S:CsTATA-box转基因拟南芥花青苷和单宁的含量与WT相比均未发生变化。
7、单宁可提高黄瓜的根腐病抗性。儿茶素处理可抑制黄瓜根腐病病原菌的生长。并且，儿茶素处理过的黄瓜幼苗抽提液可以抑制根腐病病原菌的生长，处理的浓度与抑菌效果呈正相关。用不同浓度的儿茶素处理幼苗3天再接种根腐病菌比用水处理再接种病菌的对照表现出明显的抗性。CsMYB60转基因黄瓜幼苗根腐病抗性增强，而且其抽提液可以有效抑制病原菌的生长。
8、为探明黄瓜不积累花青苷的原因，本文还分析了花青苷合成关键酶ANS的序列和基因表达。结果表明，CsANS1只在黄瓜的叶片中有较低表达，其他组织中未检测到其表达。而在黄瓜各组织器官中，均未检测到CsANS2、CsANS3基因表达。与其他植物ANS启动子相比较，黄瓜CsANS1、CsANS2、CsANS3启动子上均缺失光响应元件G-Box。因此，黄瓜ANS基因的表达缺失或表达过低是黄瓜不积累花青苷的一个关键因素。
总之，本研究表明，单宁可以增强黄瓜根腐病抗性；除果刺外，单宁和黄酮醇在黑刺黄瓜其他组织中也普遍积累；CsMYB60可直接激活CsFLS和CsLAR，并直接或间接激活CsMYC1、CsWD40、CsbHLH42和CsTATA-box，同时与这4个蛋白相互作用形成复合体共同调控关键基因Cs4CL的表达，与CsTATA-box互作调控CsCHS的表达，从而调控黄瓜单宁和黄酮醇的合成。