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志贺氏菌(Shigella)是引起食物中毒常见的肠道病原菌之一。人类对志贺氏菌有很高的易感性。因此，对志贺氏菌建立快速的行之有效的检测方法显得至关重要。环介导等温扩增技术(LAMP)以其高特异性、高灵敏性、简便、快速等特点已被广泛应用于诸多领域。本研究针对志贺氏菌的ipaH基因，设计特异性的LAMP引物，建立LAMP技术检测志贺氏菌的方法，与PCR法比较，对LAMP技术进行评价。实现了对志贺氏菌快速的检测。主要研究内容和结果如下：
1、PCR检测方法的建立。采用LAMP的外引物F3与B3作为PCR的引物，对反应体系中dNTPs浓度、Mg2+浓度、引物浓度、酶用量、退火温度和循环数进行优化。结果表明：在25μL的PCR反应体系中，最佳反应条件为：MgC12(25mmolL)2.5μL，dNTPs(10 mmol/L)1uL，引物（10μmol/L）各1.5μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，10xPCR buffer 2.5μL。反应程序为：94℃预变性5 mira 94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，进行30个循环；最后72℃延伸7 min。建立的PCR方法能特异地扩增ipaH基因。
2、LAMP检测方法的建立。实验考察了内外引物浓度比、Mg2+浓度、dNTPs浓度、Bst DNA聚合酶用量、反应温度、反应时间等反应条件对LAMP体系的影响。结果表明：在25μL的LAMP反应体系中F3与B3各0.2mmol/L，BIP与FIP 0.8mmol/L，dNTPs为0.6mmol/L，MgCl2为6.0 mmol/L，Thermopol buffer为2.5μL，Bst DNA聚合酶为(8 U/μL)8 U为最佳反应条件。建立的LAMP法在65℃条件下lh内就完成对ipaH基因的扩增，实现了对志贺氏菌的快速检测。
3、LAMP反应产物的检测。在反应过程中，从dNTPs中析出的P2074-与Mg2+结合，生成白色的Mg2P207沉淀，可以通过浑浊度来判定扩增与否；或在反应结束的eppendorf中加入核酸染料SYBR Green I，阳性结果为绿色，明显区别于阴性结果橙色，这与在体系中添加Mn2+和钙黄绿素荧光指示剂后进行扩增的结果一致。产物可用肉眼判定，检测时间≤1min，快速便捷；采用2.0％的琼脂糖凝胶电泳进一步验证，阳性扩增产物产生典型的阶梯状条带，阴性则无条带产生。从基因扩增到得到检测结果，只需一步工程即可，整个检测过程在1～2 h内即可完成。
4、研究了LAMP检测引物的特异性及检测志贺氏菌的纯菌液和基因组DNA的灵敏度。结果表明：LAMP能特异性地扩增ipaH基因，其他单一的外源DNA和共存于同一体系中的大量外源DNA不影响扩增的结果和效率；PCR方法对志贺氏菌纯培养物的最低检出浓度为1.06x102 CFU/mL，对基因组DNA的最低检出浓度为10.63 pg/μL，LAMP方法最低可以检测到约l CFU/mL的纯菌液和1.06 fg/uL的基因组DNA，比PCR更快速，更灵敏，具有很高的灵敏度，为检测食品中的志贺氏菌提供理论依据。
5、探讨不同食品基质对反应体系的影响，考查LAMP检测不同食品的效果。并采用新兴的基质溶解法处理样品，以提高检测的灵敏度。结果表明：LAMP技术能检测到人工污染番茄酱、猪肉碎肉、生菜、鸡蛋和全脂灭菌乳中的志贺氏菌的浓度分别为：4.6x103 CFU/mL、46 CFU/mL、4.6 CFU/mL、4.6 CFU/mL、8.7x10-1 CFU/mL。初步建立LAMP检测志贺氏菌的快速检测方法，该方法灵敏度高、特异性好、耗时短，为快速检测食品中的志贺氏菌构建了一个技术平台。
1、PCR检测方法的建立。采用LAMP的外引物F3与B3作为PCR的引物，对反应体系中dNTPs浓度、Mg2+浓度、引物浓度、酶用量、退火温度和循环数进行优化。结果表明：在25μL的PCR反应体系中，最佳反应条件为：MgC12(25mmolL)2.5μL，dNTPs(10 mmol/L)1uL，引物（10μmol/L）各1.5μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，10xPCR buffer 2.5μL。反应程序为：94℃预变性5 mira 94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，进行30个循环；最后72℃延伸7 min。建立的PCR方法能特异地扩增ipaH基因。
2、LAMP检测方法的建立。实验考察了内外引物浓度比、Mg2+浓度、dNTPs浓度、Bst DNA聚合酶用量、反应温度、反应时间等反应条件对LAMP体系的影响。结果表明：在25μL的LAMP反应体系中F3与B3各0.2mmol/L，BIP与FIP 0.8mmol/L，dNTPs为0.6mmol/L，MgCl2为6.0 mmol/L，Thermopol buffer为2.5μL，Bst DNA聚合酶为(8 U/μL)8 U为最佳反应条件。建立的LAMP法在65℃条件下lh内就完成对ipaH基因的扩增，实现了对志贺氏菌的快速检测。
3、LAMP反应产物的检测。在反应过程中，从dNTPs中析出的P2074-与Mg2+结合，生成白色的Mg2P207沉淀，可以通过浑浊度来判定扩增与否；或在反应结束的eppendorf中加入核酸染料SYBR Green I，阳性结果为绿色，明显区别于阴性结果橙色，这与在体系中添加Mn2+和钙黄绿素荧光指示剂后进行扩增的结果一致。产物可用肉眼判定，检测时间≤1min，快速便捷；采用2.0％的琼脂糖凝胶电泳进一步验证，阳性扩增产物产生典型的阶梯状条带，阴性则无条带产生。从基因扩增到得到检测结果，只需一步工程即可，整个检测过程在1～2 h内即可完成。
4、研究了LAMP检测引物的特异性及检测志贺氏菌的纯菌液和基因组DNA的灵敏度。结果表明：LAMP能特异性地扩增ipaH基因，其他单一的外源DNA和共存于同一体系中的大量外源DNA不影响扩增的结果和效率；PCR方法对志贺氏菌纯培养物的最低检出浓度为1.06x102 CFU/mL，对基因组DNA的最低检出浓度为10.63 pg/μL，LAMP方法最低可以检测到约l CFU/mL的纯菌液和1.06 fg/uL的基因组DNA，比PCR更快速，更灵敏，具有很高的灵敏度，为检测食品中的志贺氏菌提供理论依据。
5、探讨不同食品基质对反应体系的影响，考查LAMP检测不同食品的效果。并采用新兴的基质溶解法处理样品，以提高检测的灵敏度。结果表明：LAMP技术能检测到人工污染番茄酱、猪肉碎肉、生菜、鸡蛋和全脂灭菌乳中的志贺氏菌的浓度分别为：4.6x103 CFU/mL、46 CFU/mL、4.6 CFU/mL、4.6 CFU/mL、8.7x10-1 CFU/mL。初步建立LAMP检测志贺氏菌的快速检测方法，该方法灵敏度高、特异性好、耗时短，为快速检测食品中的志贺氏菌构建了一个技术平台。