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熊果酸(Ursolicacid,UA),属于α-香树脂醇(α-amyrin)型五环三萜类化合物,为许多中药复方的主要有效成分之一。据不完统计,在自然界已有34科108种植物中分离得到熊果酸。主要分布在女贞子、山楂、陆英、夏枯草、车前草、白花蛇舌草、连翘和苦丁茶等药用植物中,以游离形式或结合成糖苷存在。目前,从植物中提取熊果酸的技术已相当成熟,熊果酸原料的生产已商业化,且价格便宜,容易取得,国内市场上已有纯度达95％的熊果酸原粉出售。所以如果可以把熊果酸开发成为单体药将会有很好的社会和经济价值。 但是创新药物的开发是一个周期长,消耗大,风险高的过程,并且淘汰率很高,据统计,在已进行临床试验的候选化合物中,只有10%的化合物能成为药物最终上市。其中40%的化合物是因为药动学方面的原因而被终止临床试验。如果候选化合物在进入临床之前,能够借助于已经取得的动物试验和体外试验的数据对人体的药动学参数进行预测,明确其主要药动学特性,认为该化合物的主要药动学参数合适后再进入临床试验阶段,将会大大提高新药筛选的效率,消除盲目性,节约时间和成本。 药代动力学中体内代谢法的难点是药物及其代谢产物在体内的浓度都比较低,检测具有一定的难度。液相色谱-质谱联用法(LC/MS)的出现在一定程度上解决了这个问题,集液相色谱(LC)的高分离能力和质谱(MS)的高灵敏度、极强的定性专属性于一体的色谱技术,已成为药物代谢研究中不能替代的一种强有力的分离分析工具。 本文即建立了一个高灵敏度和选择性的UPLC-MS/MS方法对UA在大鼠体内的药代动力学进行分析研究,为熊果酸的进一步研究提供非临床药代动力学支持。 第一部分UA在大鼠体内的吸收UPLC-MS/MS条件为: WatersACQUITYUPLC,AgilentC18色谱柱(50mm×2.1mm,1.8μm);流动相:乙腈-水(90:10),流速0.2ml/min,柱温30℃; QuattroPremierXELC/MS/MS检测器; 离子化方式:电喷雾离子化(ESI); 检测模式:多反应检测(MRM); 锥孔电压,碰撞能量和离子选择如下所示离子通道锥孔电压碰撞能量UA:455.40>407.4070.035.0IS:469.40>355.0070.053.0 样品处理方法为乙腈直接萃取,经方法学验证在该提取方法下最低定量限为10ng/ml,精密度高中低RSD值日内分别为6.06%,7.60%,6.60%;日间分别为3.43%,5.46%,3.89%。三种浓度的提取回收率均大于80%,其相对偏差均小于10%。 大鼠分别灌胃给予熊果酸50mg/kg,100mg/kg,300mg/kg后于0min、10min、20min、40min、1h、1.5h、2h、4h、6h、8h、10h、12h和24h毛细管眼眶后静脉丛取血,按所建方法分析,根据随行标曲回归计算浓度得出浓度-时间曲线,用DAS,2.0软件处理得出主要药代动力学参数,结果表明,UA在大鼠体内吸收符合二室模型但是个体吸收差异较大,因为吸收曲线拟合度不够好,所以我们以统计矩计算为准。 第二部分UA在大鼠体内的分布 色谱条件由于组织基质干扰比较严重,处理方法改变为氯仿萃取组织匀浆,吹干用流动相定容进样,同时离子化模式使用比较稳定的大气压电离(APCI),但是系统适应性仍然无法达到要求,有待进一步研究优化。 虽然整个试验没有达到完整的对UA在大鼠体内的药代动力学进行全面研究的目标,但是积累了一定的经验,吸收部分为以后的研究提供了参考,分布和在排泄试验研究有待在将来进一步进行。