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目的:寻找日本血吸虫病新的免疫学诊断候选分子,从日本血吸虫成虫cDNA中扩增出溶血磷脂酶Sj1539基因,亚克隆至原核表达载体pET-28a中高效表达并提取重组抗原,重组抗原采用间接ELISA方法(Sj1539-ELISA)进行日本血吸虫病免疫学诊断。方法:提取日本血吸虫成虫总RNA,反转录生成cDNA,合成引物后PCR法扩增出Sj1539编码基因,与克隆载体pGEM-T连接,亚克隆至原核表达载体pET-28a,经酶切、测序证实正确后,转化入大肠杆菌BL21进行诱导表达,通过亲和层析分离纯化得到MW为25KD的重组Sj1539蛋白,SDS-PAGE和Western blot验证表达量和免疫活性。将纯化Sj1539蛋白和SjAWA包被反应板,确定最适抗原包被量和血清稀释度,采用Sj1539-ELISA、SjAWA-ELISA和SEA-IHA方法平行检测55份急性、29份慢性和30份晚期血吸虫病患者血清,36份其他寄生虫病患者血清(22份华支睾吸虫病患者血清,14份钩虫病患者血清)以及30份正常对照者血清,比较几种方法之间特异性、敏感性以及交叉反应性。结果: PCR法扩增出一条大小约为684bp的目的DNA片断,将其亚克隆原核表达质粒pET-28a,诱导表达后,经SDS-PAGE可见一条约25KDa大小的蛋白条带。亲和层析法纯化Sj1539样蛋白,经Western-blot验证目的蛋白Sj1539能够与特异性抗体进行反应。使用该蛋白作为抗原进行ELISA、与SjAWA-ELISA和SEA-IHA方法平行检测急、慢性和晚期血吸虫病患者,华支睾吸虫病患者、钩虫病患者和正常对照者血清,实验结果显示:Sj1539-ELISA和SjAWA-ELISA,对于上述55份急性血吸虫病患者血清检测的敏感性分别为89.0%和92.7%,经校正X~2检验无显著性差异(X~2 = 0.44,p> 0.05);对于29份慢性血吸虫病患者血清,Sj1539-ELISA和SjAWA-ELISA检测的敏感性分别为65.5%和55.2%,经校正X~2检验无显著性差异(X~2 = 0.65,p> 0.05);对于30份晚期血吸虫病患者血清, Sj1539-ELISA和SjAWA-ELISA检测的敏感性分别为86.7%和80.0%,经校正X~2检验无显著性差异(X~2 =0.48,p> 0.05);对于30份正常人血清,两种检测方法的假阳性率分别为3.3%和3.3%,无差异;对于36份其他寄生虫病患者血清(华支睾吸虫病患者血清22份,钩虫病患者血清14份),Sj1539-ELISA和SjAWA-ELISA检测的血清抗体的阳性率分别为8.3%和13.9%,经校正X~2检验无显著性差异(X~2 = 0.14,p> 0.05)。Sj1539-ELISA和SEA-IHA,对于55份急性血吸虫病患者血清检测的敏感性分别为89.0%和96.4%,经校正X~2检验无显著性差异(X~2 =1.21,p> 0.05);对于29份慢性血吸虫病患者血清,Sj1539-ELISA和SEA-IHA检测的敏感性分别为65.5%和69.0%,经校正X~2检验无显著性差异(X~2 =0.08,p>0.05);对于30份晚期血吸虫病患者血清, Sj1539-ELISA和SEA-IHA检测的敏感性分别为86.7%和86.7%,无差异;对于30份正常人血清,两种检测方法的假阳性率分别为3.30%和0.00%,经校正X~2检验无显著性差异(X~2 = 1.02,p>0.05);对于36份其他寄生虫病患者血清(华支睾吸虫病患者血清22份,钩虫病患者血清14份),Sj1539-ELISA和SEA-IHA检测的血清抗体的阳性率分别为8.3%和2.8%,经校正X~2检验无显著性差异(X~2 = 0.26,p>0.05)。在本实验中Sj1539-ELISA法假阳性率略高于SEA-IHA法,交叉反应低于SjAWA-ELISA法,在诊断急、慢性和晚期血吸虫病中与SjAWA-ELISA和SEA-IHA法有着相似的敏感性、特异性。本法操作简便,易于标准化。本研究Sj1539样蛋白在诊断中的交叉反应较少,表明Sj1539样蛋白在血吸虫病免疫诊断上具有较大的应用潜能。结论:本研究扩增克隆日本血吸虫溶血磷脂酶Sj1539蛋白基因,在原核细胞BL21中表达纯化Sj1539蛋白,以Sj1539-ELISA方法诊断日本血吸虫病。Sj1539蛋白制备方法简便,成本相对低廉,提取及检验方法易于标准化,有可能更适宜商品化生产进行流行区血吸虫病的血清学辅助诊断。