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磷(P)是植物生长和发育不可缺少的大量营养元素。植物已经进化出复杂的生理和分子调节机制,以增加磷酸盐(Pi)的吸收、利用和再活化以维持体内的P稳态。PHO2(Phosphate 2)是植物磷吸收和磷平衡的重要调控因子。PHO2mRNA受到miRNA399的靶向剪切,而缺磷诱导的长非编码RNAIPS1可以抑制这一过程。CK2(Casein Kinase 2)是磷吸收和磷平衡的另一重要调控因子,CK2可以磷酸化磷酸盐转运体(Phosphate Transporter, PT),影响PT从内质网往质膜转运进而调控磷吸收。但PHO2是否涉及以及如何进行翻译后调节,CK2是否调节除PT之外的磷信号调控组分目前尚不清楚。
酵母双杂交实验(yeast two-hybrid,YTH)结果表明水稻CK2的四个亚基中只有CK2α3可以与PHO2互作,该互作发生在PHO2的N端。亚细胞定位实验表明两者主要在内质网共定位。原位PCR实验显示CK2α3在根部从表皮到中柱都有表达,而PHO2主要在中柱细胞表达,表明两者可能在中柱细胞的内质网发生互作。生理实验结果显示α3Ri、pho2和α3Ripho2双突变体叶片磷含量均高于野生型,而双突变体的磷含量高于两个单突变体,说明两者在水稻磷平衡中起到类似的作用。
体外磷酸化实验表明CK2α3可以磷酸化PHO2。进一步对质谱得到的三个体外磷酸化位点进行分析发现CK2α3磷酸化PHO2的841位丝氨酸。CK2α3对PHO2的磷酸化不影响PHO2在内膜系统的亚细胞定位,也不影响CK2α3与PHO2的互作,但是磷酸化加速了PHO2的降解。体内磷酸化实验也发现PHO2在水稻体内受CK2α3磷酸化修饰。将野生型PHO2(PHO2)、PHO2磷酸化位点突变为模拟磷酸化形式(PHO2S841D)和非磷酸化形式(PHO2S841A)的三种形式的PHO2基因组分别转入pho2突变体进行转基因回复,结果表明三种基因型均可以恢复pho2弱小的长势,但是PHO2S841A回复株系生物量回复地最好,它的干重最高,并且降低pho2叶片的磷含量程度最大,而PHO2S841D回复株系的干重最低,只少量降低pho2叶片磷含量。
BiFC实验(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)和酵母双杂交实验表明PHO2与PHO1的N端结合。体外降解实验显示PHO2通过MVB(多泡体)途径降解PHO1。进一步的实验表明PHO2S841A转基因回复株系中PHO1的降解最快而PHO2S841D株系中PHO1降解最慢,与PHO2的蛋白水平变化和最终的叶片磷含量结果一致。
综上所述,本研究揭示了CK2α3与PHO2在植物体内互作并通过非典型CK2识别基序磷酸化PHO2的Ser-841,Ser-841磷酸化加速了PHO2的降解;PHO2可以靶向PHO1降解,这些基因共同调节了水稻的Pi稳态。研究结果为阐明植物适应低磷逆境的分子调控机制提供了新的知识,并为通过基因工程育种等方法提高作物对Pi的吸收和利用效率提供了更多的科学依据。
酵母双杂交实验(yeast two-hybrid,YTH)结果表明水稻CK2的四个亚基中只有CK2α3可以与PHO2互作,该互作发生在PHO2的N端。亚细胞定位实验表明两者主要在内质网共定位。原位PCR实验显示CK2α3在根部从表皮到中柱都有表达,而PHO2主要在中柱细胞表达,表明两者可能在中柱细胞的内质网发生互作。生理实验结果显示α3Ri、pho2和α3Ripho2双突变体叶片磷含量均高于野生型,而双突变体的磷含量高于两个单突变体,说明两者在水稻磷平衡中起到类似的作用。
体外磷酸化实验表明CK2α3可以磷酸化PHO2。进一步对质谱得到的三个体外磷酸化位点进行分析发现CK2α3磷酸化PHO2的841位丝氨酸。CK2α3对PHO2的磷酸化不影响PHO2在内膜系统的亚细胞定位,也不影响CK2α3与PHO2的互作,但是磷酸化加速了PHO2的降解。体内磷酸化实验也发现PHO2在水稻体内受CK2α3磷酸化修饰。将野生型PHO2(PHO2)、PHO2磷酸化位点突变为模拟磷酸化形式(PHO2S841D)和非磷酸化形式(PHO2S841A)的三种形式的PHO2基因组分别转入pho2突变体进行转基因回复,结果表明三种基因型均可以恢复pho2弱小的长势,但是PHO2S841A回复株系生物量回复地最好,它的干重最高,并且降低pho2叶片的磷含量程度最大,而PHO2S841D回复株系的干重最低,只少量降低pho2叶片磷含量。
BiFC实验(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)和酵母双杂交实验表明PHO2与PHO1的N端结合。体外降解实验显示PHO2通过MVB(多泡体)途径降解PHO1。进一步的实验表明PHO2S841A转基因回复株系中PHO1的降解最快而PHO2S841D株系中PHO1降解最慢,与PHO2的蛋白水平变化和最终的叶片磷含量结果一致。
综上所述,本研究揭示了CK2α3与PHO2在植物体内互作并通过非典型CK2识别基序磷酸化PHO2的Ser-841,Ser-841磷酸化加速了PHO2的降解;PHO2可以靶向PHO1降解,这些基因共同调节了水稻的Pi稳态。研究结果为阐明植物适应低磷逆境的分子调控机制提供了新的知识,并为通过基因工程育种等方法提高作物对Pi的吸收和利用效率提供了更多的科学依据。