论文部分内容阅读
三氯卡班(Triclocarban，TCC)是一种广谱氯代芳香抗菌剂，大量的应用于日常生活各类个人护理用品、消毒液以及备用品中，对革兰氏阴性、阳性菌和真菌都有一定的抑制作用。由于TCC水溶性极差，导致污水处理过程中活性污泥吸附是其主要的去除途径，最后随剩余污泥排放到环境中。环境中的TCC非常稳定，在各种水体和底质环境中均被频繁检出，不仅会影响水生藻类的活性，还对动物的生殖能力和内分泌造成影响，并且TCC及其转化产物为潜在诱癌物，同时也具有诱发微生物抗性基因产生的风险。我国是TCC的使用大国，近些年来TCC在我国乃至全球开始得到广泛的关注。利用微生物进行TCC的降解是一种有效、经济和绿色的去除方法。因此，富集分离出高效的TCC降解菌，丰富TCC的降解菌种资源，研究其降解分子机理，发掘其生物修复潜质，为强化生物修复TCC污染环境提供理论与技术基础。 本研究旨在于针对二级出水及环境介质中TCC残留进行进一步的生物强化处理，以期达到去除、脱毒无害化的效果，丰富TCC降解菌的微生物多样性，重点挖掘TCC双酰胺键水解酶编码关键基因，为表征TCC在生物修复过程中的催化活性提供重要的分子标记;同时在分子和生化水平上揭示TCC的微生物降解途径和分子机理。 本研究从不同地点分离得到两株三氯卡班降解菌，两菌不能利用TCC为唯一碳源进行生长，水解TCC中双酰胺键生成4-氯苯胺(4CA)和3，4-二氯苯胺(DCA)，两株菌经16S rRNA基因鉴定均属于Ochrobactrum sp.，命名为菌株TCC-1和TCC-2，可在温度和pH范围为20℃-40℃和5.2-9.0下降解TCC，增大接种量和提供共基质可以促进TCC的降解和产物的积累，两株菌可以耐受较高的TCC浓度(＞30mg/L)。 通过构建降解菌TCC-2的基因组DNA文库，获得了一个阳性克隆子U135，能有效降解TCC的双酰胺键生成4CA和DCA，该基因编码的酰胺酶命名为TccA（GenBank登录号KU753911），核酸序列大小为1425bp，编码474aa。与NCBI数据库中Swiss-Prot专业数据库中蛋白序列进行比对发现，TccA与Rhodococcus sp.Oct1中生化鉴定的邻硝基乙酰苯胺水解酶OctH最高同源性38％，与来自Streptomyces推定酰胺酶同源性介于51％-53％，TccA为一个全新的具有酰胺键水解功能的酰胺酶。进一步比对分析发现，TccA含有酰胺酶家族中高保守氨基酸motif区域GGSSGG，和该家族催化保守三分子(Lys98-Ser176-Ser200)。在E.coil BL21中高效表达了TccA，确定其分子量为50kDa，为单体蛋白。 TccA在温度低于70℃和pH在5.0-10.0之间时，酶的催化活性保持较好，在偏碱性pH条件下，酶的稳定性和催化活性都与最适反应条件差异不大。TccA反应最适温度为35℃，最适pH为8.0。1mM金属离子中仅Ag+对该酶有强烈抑制作用，化学抑制剂1，10-邻菲哕啉、对甲基磺酰氟、吐温-80和焦碳酸二乙酯可抑制40％-60％酶催化活性。TccA作用底物具有广谱性，不仅可以水解TCC及其脱卤同系物4，4-二氯苯基脲(4，4-dichlorocarbanilide，DCC)和双苯基脲（carbanilide，NCC）的双酰胺键，还可以水解部分除草剂、杀虫剂和化学合成中间体，包括除草剂敌稗，利谷隆，苯胺灵，氯苯胺灵，除虫剂除虫脲，化学合成中间体4-氯苯基脲，4-溴苯基脲，1-（3，4-二溴苯基）脲，乙酰苯胺，医药品对乙酰氨基酚和植物生长调节剂氯吡脲，其中TCC，DCC，NCC，除虫脲和氯吡脲可以水解两个酰胺键。通过测定酶活力参数，最高值对应底物NCC，其次为TCC，均大于DCC。该酶的表达不受底物的诱导，经RT-qPCR确认TccA为组成型表达，这对于去除环境中低浓度底物残留具有重要意义。通过比较两株TCC降解菌tccA基因附近的区域发现，含有多个编码转座酶和整合酶的序列，推测TCC降解菌属Ochrobactrum中该基因可能由基因水平转移进化而来。 基于TCC大量存在的沉积物和生物质通常氧气不足，因此在微氧/厌氧条件下以硝酸盐作为电子受体进行Ochrobactrum sp.TCC-1的培养，同样可以水解TCC，DCC，NCC为氯苯胺和苯胺产物。微氧及碳氮比高的条件更利于降解菌生物量积累，及促进底物水解效率。在厌氧剩余污泥体系中批次补充一定的电子受体硝酸盐，发现可以支持菌株TCC-1的定殖和底物TCC水解，氯苯胺产物持续积累，生物量也可以稳定在一定的水平，这些结果为基于生物刺激和生物强化的TCC污染环境生物修复奠定了理论基础。 另外，从污水处理厂剩余污泥中分离得到TCC降解产物氯苯胺的高效降解菌，该菌可以利用3，4-二氯苯胺作为唯一碳源、氮源和能源生长，该菌经16S rRNA基因鉴定属于Diaphorobacter菌属，命名为Diaphorobacter sp.LD72。不同的碳氮源对该菌生长和底物降解的影响不同，丙氨酸和有机氮源对生长和降解的促进明显，菌株LD72也可以降解苯胺，间位和对位取代的一氯和二氯苯胺和溴代的苯胺，4-氟苯胺，对不同浓度的底物适应性也较强，降解过程伴随当量摩尔的卤离子释放，基于基因组测序分析推测双加氧酶参与卤代苯胺降解过程。当将氯苯胺的降解菌LD72与TCC的降解菌TCC-2共培养作用于TCC的降解时，可以实现TCC的矿化，这为后期环境中TCC的彻底去除奠定实验基础。