论文部分内容阅读
本论文包括两方面内容：铜绿假单胞菌烯酰-ACP还原酶抑制剂先导化合物筛选和一株高效降解2-甲基异茨醇微生物的筛选鉴定及其BAC文库的构建。 本研究通过计算机辅助的虚拟药物筛选方法，从中药化合物库中分离出五种可能具有烯酰-ACP还原酶（FabI）抑制能力的中药单体作为先导化合物。分别是：姜黄素（Curcumin）、木犀草素（Luteolin）、欧前胡素（Imperatorin）、染料木素（Genistein）和白藜芦醇苷（Polydatin）。 克隆表达了铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa ATCC15442 FabI（PaFabI），并成功构建的由FabI催化的体外反应体系。通过该体系检测了五种先导化合物对大肠杆菌Escherichia coli FabI（EcFabI）和PaFabI的抑制能力。它们对EcFabI的抑制能力由大到小依次为：木犀草素、欧前胡素、白藜芦醇苷、姜黄素和染料木素。对PaFabI的抑制能力依次为：三氯生、木犀草素、白藜芦醇苷、染料木素和姜黄素，而欧前胡素对PaFabI催化的还原反应起到了明显的促进作用。 抗菌实验结果表明，姜黄素对野生型E.coli MG1655的生长具有显著的抑制效果，MIC90为0.2μmol/L；而对过量表达EcFabI的E. coli CY1655则没有表现出抗菌活性；此外姜黄素对P.aeruginosa ATCC15442也有微弱的抑制能力，MIC90为5μmol/L。木犀草素对P.aeruginosa ATCC15442有一定的抗菌能力，MIC90为1.0μmol/L。 综合菌体水平和酶体水平的实验结果，对木犀草素和姜黄素对EcFabI的抑制，木犀草素和白藜芦醇苷对PaFabI的抑制做进一步分析。结果表明：木犀草素通过反竞争抑制模型对EcFabI和PaFabI进行抑制，其Ki值分别为7.05nmol/L和0.40nmol/L；姜黄素通过和木犀草素相同的方式抑制EcFabI的活性，其Ki值为14.96nmol/L；白藜芦醇苷通过竞争性抑制机制对PaFabI产生抑制效果，其Ki值为0.40nmol/L。 2-甲基异茨醇（2-MIB）是一种放线菌和蓝细菌等微生物的次生代谢产物，2-MIB的过量累积引起了养殖水体及饮用水的异味问题，已经成为目前水污染研究的热点。目前，常规水处理工艺无法有效的去除污染水体中微量2-MIB，生物治理则能够避免常规物理化学等处理方法的弊端，成为2-MIB水体污染治理的最新研究方向。 本研究通过格氏反应以d-樟脑为底物合成了纯度达到98%的2-MIB。并从湖北省武汉市各地采集的污水水样中成功分离出一株能够高效降解2-MIB的微生物菌株，降解率最高可达89.7%。16SrDNA鉴定结果显示，该菌株为阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）。此外，还通过基因工程手段成功构建了该高效降解菌的BAC文库，共获得810个转化子，外源片段平均大小为40kb，文库覆盖率为8倍。BAC文库的构建为今后研究该菌降解2-MIB的分子机制打下良好平台。