棉花GhTED2基因的克隆和功能分析

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细胞程序性死亡(programmed cell death,PCD)是一种由细胞内基因控制的为维持内环境稳定的自主衰亡过程。植物维管系统在植物组织各部分的联结方面起着重要的作用,它是由机械组织、输导组织、分生组织和薄壁组织四部分组成的,具有贮存和运输物质、机械支持、传递信息、阻止真菌和其它寄生物入侵等功能。在高等植物中,输导组织的主要代表是韧皮部和木质部。木质部是由木薄壁细胞、木纤维和管状分子(tracheary element,TE)组成的,管状分子TE是一种高度特化的细胞。从PCD被引进植物生物学以来,许多研究都已经证明TE的分化是一种典型的PCD过程,但它含有一般细胞PCD所没有的次生壁构建过程,因而不属于常规意义上的PCD[1,2]。近些年来,维管组织分化的研究已经从细胞学水平进展到了分子水平。相关学者已从百日草(Zinnia elegans)叶肉细胞体外分化形成TE的过程中,克隆出了4个TE相关基因(TED1~4)[1,3]。其次,百日草叶肉细胞分化成木质部管状分子的实验表明,TED2属于编码细胞NADPH氧化还原酶的一个基因,它的表达受到油菜素类固醇、Ca2/钙调素等多种因子的正调控,其调控反应产生H2O2和O2,能够诱发木质部管状分子(tracheary element,TE)的PCD。  本研究内容主要涉及棉花GhTED2基因的克隆和构建该基因相应的表达载体,并进行烟草的转化,得到该基因过量表达的转基因植株进行功能鉴定。具体的研究方法是以已知的陆地棉cDNA文库中的包含5端序列部分的TED2基因序列为基础,利用3 RACE技术得到陆地棉TED2基因的3端序列,首次从陆地棉中成功扩增出了全长为1371bp的陆地棉TED2cDNA全长序列,其中ORF为975bp,共编码324个氨基酸(NCBI收录号为FJ372981.1)。分别采用RT-PCR半定量法和Real-time PCR定量法对TED2基因在陆地棉根、茎、叶各组织中的表达量进行的分析,实验结果表明该基因在陆地棉根、茎、叶各组织中均表达,其中在早期发育的陆地棉根和叶中优势表达。利用植物表达载体pBI121作为骨架,将陆地棉TED2基因引入,构建成植物表达基因pBI121-TED2(简写为pBTED2),该基因由组成性表达启动子CaMV35S驱动。通过农杆菌介导法转化烟草,对转基因不定芽进行选择和根的再生,共获得80个转基因再生株。利用PCR初步筛查共获得68株为转基因PCR阳性株,进一步的分子检测结果表明TED2基因已经成功的整合到转基因烟草基因组中并在烟草中成功的进行了转录。同时利用PEG胁迫实验对再生的第二代转基因TED2烟草进行了抗旱分析,初步证明该基因对干旱有一定的抗性。本论文中对陆地棉TED2基因的研究结论为进一步研究棉花的纤维发育和抗病性等方面提供理论研究基础。
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