棉铃虫离子型受体的基因克隆、表达定位及功能研究

来源 :中国农业科学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:czh126
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昆虫主要依赖灵敏的嗅觉系统识别环境中的各种化学物质,这些化学信号经进一步加工整合最终引发特定的行为反应,如定位寄主植物、选择产卵场所等。在嗅觉识别过程中,多种化学感受相关蛋白参与到其中。随着棉铃虫触角转录组和基因组的测序完成,多种嗅觉感受相关的蛋白相继被鉴定。目前,对于棉铃虫嗅觉相关蛋白的研究主要集中在气味受体和气味结合蛋白上,而离子型受体作为另一类嗅觉受体,其功能尚未被揭示。本研究在棉铃虫触角转录组测序和分析的基础上,克隆了6个离子型受体基因并分析了它们的序列结构,对HarmIR8a和HarmIR25a在触角中的表达位置进行了定位研究,记录了棉铃虫腔锥形感器神经元的功能,并对离子型受体的体外功能进行了初步鉴定。为深入研究棉铃虫化学识别机制、寻找新的防治靶标以及发展绿色行为调控剂提供了一定的分子基础。主要结果如下:  1.利用PCR和RACE技术,克隆了6棉铃虫离子型受体全长序列,包括HarmIR8a,HarmIR25a,HarmIR21a,HarmIR41a,HarmIR76b和HarmIR64a。  2.利用生物信息学方法对上述6个棉铃虫离子型受体氨基酸序列、跨膜结构域及保守功能域等进行了分析。氨基酸序列比对结果显示,HarmIR8a和HarmIR25a与其它昆虫种群对应氨基酸的相似度较高,相对保守;而HarmIR21a,HarmIR41a,HarmIR76b和HarmIR64a与其它种群相比保守性相对较低。对HarmIR8a和HarmIR25a蛋白结构分析结果显示,其均含有一个N端的氨基酸末端区域(ATD),跨膜域(M1,M2和M3),一个离子通道(P),一个由S1和S2组成的配体结合域和一个胞内C端。  3.利用荧光定量qPCR技术检测了HarmIR8a,HarmIR25a,HarmIR76b,HarmIR21a,HarmIR41a和HarmIR64a分别在棉铃虫雌雄成虫8个组织中的相对表达量。结果表明HarmIR8a在棉铃虫雌雄虫的头部、触角等组织中均有表达,而且在雌雄虫触角中高表达;HarmIR25a在雌、雄虫触角中表达量最高,在其它组织中表达量较低。HarmIR76b除触角中高表达外,在喙等部位表达量也较高;HarmIR64a在所有组织中均有表达,其中在触角等中表达量相对较高;同时HarmIR21a和HarmIR41a均在触角中高表达。  4.利用原位杂交技术初步明确了HarmIR8a和HarmIR25a在棉铃虫触角感受器中的表达定位。结果表明2个离子型受体主要在棉铃虫触角的腔锥形感器下表达,在其它感器(毛形感器、锥形感器、刺形感器等)中未检测到杂交信号。  5.利用单细胞记录技术,对棉铃虫触角腔锥形感器的神经元功能进行了鉴定。结果表明,经记录的腔锥形感器神经元对酸类、胺类、醛类及酯类等气味物质均有电生理反应,但是对两种萜烯类化合物(柠檬烯和α-蒎烯)均没有电生理反应。同时将棉铃虫触角腔锥形感器划分为4个功能亚型,包括TypeA,Type B,Type C和TypeD型,每个亚型中神经元的功能有一定的分化。  6.利用爪蟾卵母细胞结合双电极电压钳系统,初步研究了6个离子型受体在不同组合模式下对植物挥发物的体外功能。结果表明供试气味均不能引起所选受体组合模式任何电生理反应。
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