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莱芜猪是我国优良的地方猪种资源之一,以性成熟早、繁殖力高、抗逆性强、肉质优良等特性而著称。构建莱芜猪cDNA文库不仅保存了莱芜猪的基因资源,而且对莱芜猪已知功能的特异基因的克隆、表达以及新基因的筛选和功能研究具有重要意义。
本研究成功地构建了莱芜猪肝脏组织的质粒cDNA文库和λ噬菌体cDNA文库,并进行了小规模的EST测序和生物信息学分析,为进一步研究和开发利用莱芜猪这一宝贵的地方猪种奠定了物质基础。主要内容如下:
1.采用改良的异硫氰酸胍一步法从莱芜猪肝脏组织中制备总RNA。利用SMART技术,以PowerscriptTM反转录酶逆转录合成cDNA第一链,通过长距离PCR(LD-PCR)扩增获得双链cDNA。经蛋白酶K消化和分级分离后,收集500 bp以上的cDNA片段,并与pMD18-T载体连接,转化E.coli DH5α感受态细胞,建成原始文库。随机挑取单菌落,用HindⅢ和.EcoRⅠ进行双酶切鉴定重组子插入片段大小。经鉴定,莱芜猪肝脏组织的原始质粒cDNA文库的滴度为2.8×105cfu／mL,,重组率约为98％,插入片段大小在0.5～2 kb之间,平均插入片段长度为1 kb。
2.利用SMARTScribeTM MMLV反转录酶,以莱芜猪肝脏分离纯化的总RNA为模板合成一链cDNA,通过LD.PCR技术扩增获得双链cDNA,经蛋白酶K消化和SfiⅠ酶切后过柱分级分离,收集500 bp以上的cDNA片段与λTriplEx2载体连接。连接产物经体外蛋白包装产生原始文库；检测文库的滴度和重组率后进行文库扩增。随机挑取噬菌斑通过PCR技术鉴定重组子插入片段大小。经鉴定,莱芜猪肝脏组织的原始λ噬菌体cDNA文库的滴度为1.47×106pfu／mL,,重组率大于98％,插入片段大小分布在O.75～2.5 kb之间,平均插入片段长度为1.2 kb。扩增后文库的滴度为5.8×109pfu／mL。
3.用大肠杆菌BM25.8将λ噬菌体cDNA文库质粒化,从中随机挑取阳性克隆从5ˊ端进行测序,获得4个表达序列标签(EST)。利用BLAST工具将获得的4个ESTs分别同NCBI的非冗余核酸序列和蛋白质数据库进行同源性比对和生物信息学分析。结果表明这4个ESTs均与数据库中的已知序列有高度同源性。分析4个克隆的ESTs序列所包含的ORF及其蛋白质结构域,进一步推断其功能。结果表明,LW2克隆的最大ORF为171 bp,编码56个氨基酸,BLASTp分析发现该氨基酸序列含有与脂多糖结合活性的Sushi-2保守结构域；LW9克隆的最大ORF为333 bp,编码110个氨基酸,分子量12.2 kD,该氨基酸序列含有与次级代谢物合成、运输、分解代谢相关的细胞色素P450保守结构域；LW11克隆的最大ORF为831 bp,编码276个氨基酸,分子量30.7 kD,该氨基酸序列含有与物质运输相关的白蛋白保守结构域:LW12克隆的最大ORF为435 bp,编码144个氨基酸,分子量16 kD,该氨基酸序列含有与凝血有关的纤维蛋白原相关结构域。4个EST的获得从几个功能侧面反映了肝脏作为“物质代谢中枢”的重要性,为后续进行大规模EST测序和分析奠定了基础。