家蚕Bm040825基因的表达及其功能初步研究

• 作 者: 吴涛
• 机 构: 浙江理工大学
• 出 处: 浙江理工大学
• 发表日期: 2008年期
• 关键词: 基因表达 DNA文库 基因组序列 序列比对 酶切位点 特异性蛋白

从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中筛选得到一条新的cDNA，经NCBI比对分析后初步确定其为一未知基因，命名为家蚕Bm040825(Bombyxmori040825)，GenBank登陆号为DN236938。家蚕Bm040825基因cDNA长为869bp，开放阅读框大小为489bp，采用DNrAStar软件进行预测发现该基因编码162个氨基酸残基，预测分子量大小为19.4kD，等电点为9.58。从GenBank等数据库中利用Blast检索，发现与Bombyxmori同源性较高的均为一些假设或预测蛋白，这些蛋白功能未知。将家蚕Bm040825的cDNA序列与家蚕基因组序列比对，结果表明该基因由一个外显子组成。
我们根据cDNA序列的ORF框设计上下游引物，PCR扩增后经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，插入融合表达载体pET-28a(+)的相应酶切位点，成功构建重组融合蛋白表达质粒并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，经PCR、酶切鉴定以及测序分析证实重组正确。IPTG诱导后裂解菌作SDS-PAGE分析，在23kD处有一浓集特异性蛋白条带，与预期值相符。重组蛋白以可溶的形式表达，通过亲和层析纯化了重组蛋白，并使用该重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体，ELISA检测效价大于1:6400。以家蚕Bm5细胞进行免疫细胞化学实验，结果显示，在未分裂细胞中，Bm040825蛋白在细胞核与细胞质当中均有分布，而对于处在分裂期的细胞，Bm040825蛋白主要分布在细胞质中，在细胞核内几乎不存在。构建绿色荧光重组表达质粒pEGFP-N1-Bm040825转染家蚕Bm5细胞做亚细胞定位，在转染后36h，我们只在细胞核当中检测到绿色荧光信号，而转染后48h，在细胞核和胞质中均发现融合绿色荧光的分布。提取家蚕五龄幼虫各组织的总蛋白，进行免疫印迹实验，结果显示，Bm040825蛋白在家蚕的中肠组织中有表达，但在丝腺等其他组织中没有检测到该蛋白的存在，我们认为该蛋白属家蚕中肠特异性蛋白。这些结果为深入研究Bm040825蛋白奠定了基础。