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帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种以黑质致密带多巴胺(dopamine,DA)能神经元进行性缺失为特征的中枢神经系统退行性疾病。其临床表现为运动不能、肌僵直、静止性震颤及姿势反射障碍等。尽管研究显示遗传、环境和年龄等因素均可能参与PD发病,但其确切病因不清。PD的主要病理特征是黑质(substantia nigra,SN)致密部多巴胺能神经元缺失和路易小体(Lewy body,LB)的形成。α-突触核蛋白是LB的主要成分,神经元中α-突触核蛋白的异常聚集能够改变细胞膜电位、损伤线粒体功能、诱导内质网(endoplasmic reticulum,ER)应激而造成细胞损伤,其中内质网应激是α-突触核蛋白的核心毒性作用机制之一。除了长期以来关注的其在细胞内的毒性作用之外,α-突触核蛋白能够被神经元释放,进而被周围的细胞(包括神经元、胶质细胞等)再摄取,从而能够在细胞-细胞之间、相互联系的结构之间进行传递。铁沉积是PD另一重要的神经病理学改变,尸检证据表明,PD黑质区单个神经元内的铁含量增高,黑质铁的水平与PD的进程相关。本课题组前期研究证实铁能够促进α-突触核蛋白的聚集,增强α-突触核蛋白在细胞内的毒性作用,然而铁沉积与细胞间传播的α-突触核蛋白之间的关系尚未有研究报道。以往神经退行性疾病的研究热点都集中在特定受损的神经元上,占脑体积20%-50%的星形胶质细胞在神经系统的发育、突触传递、离子平衡、神经免疫等方面,都起着十分重要的作用,因此星形胶质细胞在神经退行性疾病的作用开始受到关注。星形胶质细胞本身表达极低水平的α-突触核蛋白,但其能摄取胞外的α-突触核蛋白。进入到星形胶质细胞内的α-突触核蛋白的聚集促进促炎因子和化学因子的释放,进而导致神经元的损伤和小胶质细胞的继发性激活。本研究选用C6胶质瘤细胞(星形胶质细胞瘤的细胞系),原代培养的腹侧中脑(ventral mesencephalon,VM)星形胶质细胞及VM神经元为细胞模型,应用蛋白免疫印迹、免疫荧光、荧光实时定量PCR、流式细胞术等方法,深入探讨细胞外的α-突触核蛋白处理后VM星形胶质细胞促炎因子的变化及铁对此过程的影响,并评价内质网应激是否参与了细胞外α-突触核蛋白的毒性作用,并观察VM神经元的损伤变化。研究结果如下:1.100 nmol/L、300 nmol/L的α-突触核蛋白单体处理C6胶质瘤细胞24 h后,IL-1β mRNA的升高分别约为对照组的1.83、2.69倍,TNF-αmRNA的升高分别约为对照组的1.35、1.74倍,与对照组相比差别有统计学意义(P<0.01);且100 nmol/L组与300 nmol/L组相比差别有统计学意义(P<0.01)。以上结果说明,α-突触核蛋白单体能够引起C6胶质瘤细胞促炎因子表达增加,且促炎因子的表达升高对α-突触核蛋白具有浓度依赖性。2.100 nmol/L、300 nmol/L的α-突触核蛋白单体处理VM星形胶质细胞24 h后,IL-1βmRNA的升高分别约为对照组的9.58、21.7倍,TNF-αmRNA的升高分别约为对照组的4.80、6.17倍,与对照组相比差别有统计学意义(P<0.0001),且100 nmol/L组与300 nmol/L组相比差别有统计学意义(P<0.01)。以上结果说明,α-突触核蛋白单体能够引起VM星形胶质细胞促炎因子表达增加,且促炎因子的升高对α-突触核蛋白具有浓度依赖性。3.100μmol/Lα-突触核蛋白单体37℃恒温振荡3 d,制备α-突触核蛋白纤维体。100nmol/L、300 nmol/L的α-突触核蛋白纤维体处理VM星形胶质细胞24 h后,IL-1βmRNA的升高分别约为对照组的3.22、7.91倍,TNF-αmRNA的升高分别约为对照组的3.09、4.33倍,与对照组相比差别有统计学意义(P<0.05),且100 nmol/L组与300 nmol/L组相比差别有统计学意义(P<0.05)。α-突触核蛋白纤维体引起促炎因子的升高水平低于α-突触核蛋白单体组,与α-突触核蛋白单体组相比,差别有统计学意义(P<0.05)。以上结果说明,α-突触核蛋白纤维体也能够引起VM星形胶质细胞促炎因子表达增加,且促炎因子的升高对α-突触核蛋白具有浓度依赖性;但α-突触核蛋白单体对VM星形胶质细胞的毒性要高于α-突触核蛋白纤维体。4.100 nmol/L的α-突触核蛋白单体处理C6胶质瘤细胞24 h后,内质网应激相关蛋白CHOP、ATF-4、XBP-1s的表达升高,分别约为对照组的1.33、2.05、1.24倍,与对照组相比差别有统计学意义(P<0.05)。300 nmol/L的α-突触核蛋白组,CHOP、ATF-4、XBP-1s的表达升高,分别约为对照组的1.50、2.10、1.25倍,与对照组相比差别有统计学意义(P<0.05)。以上结果说明,细胞外的α-突触核蛋白能够诱导C6胶质瘤细胞出现内质网应激。自噬溶酶体途径(autophagy-lysosome pathway,ALP)抑制剂氯喹(40μmol/L)或泛素蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)抑制剂MG132(20μmol/L)单独处理细胞24 h后,CHOP、ATF-4的表达升高,提示抑制ALP或UPS均可诱导细胞出现内质网应激。氯喹与α-突触核蛋白共孵育后与单独氯喹处理组相比没有显著差别,提示进入细胞内的α-突触核蛋白能够经UPS降解。而MG132与α-突触核蛋白共孵育后与单独MG132处理组相比明显下降,差别有统计学意义(P<0.0001)。以上结果说明,进入到细胞内的 α-突触核蛋白可以诱导C6胶质瘤细胞出现内质网应激;细胞外进入到细胞内的α-突触核蛋白可以经UPS和ALP降解,且ALP在UPS被抑制的情况下更容易被细胞外的α-突触核蛋白诱导增强。5.100 nmol/L的α-突触核蛋白单体处理VM星形胶质细胞24 h后,内质网应激相关蛋白CHOP、ATF-4、XBP-1s的表达升高,分别约为对照组的1.96、2.23、1.29倍,与对照组相比差别有统计学意义(P<0.05)。300 nmol/L的α-突触核蛋白组,CHOP、ATF-4、XBP-1s的表达升高,分别约为对照组的2.02、2.32、1.48倍,与对照组相比差别有统计学意义(P<0.05)。以上结果说明,α-突触核蛋白能够诱导VM星形胶质细胞出现内质网应激。6.10μmol/L、100μmol/L枸橼酸铁铵(ferric ammonium citrate,FAC)处理C6胶质瘤细胞24 h后,10μmol/L FAC组促炎因子表达量较对照组没有变化,与100nmol/L的α-突触核蛋白单体共孵育细胞24 h后,促炎因子的表达量较α-突触核蛋白组没有显著变化。100μmol/L FAC组促炎因子表达量较对照组增加,IL-1β、TNF-αmRNA的升高约为对照组的1.72、1.37倍,差别有统计学意义(P<0.05),与100 nmol/L的α-突触核蛋白单体共孵育细胞24 h后,促炎因子的表达量较α-突触核蛋白组也没有显著变化。以上结果说明,C6胶质瘤细胞内铁水平升高对细胞外α-突触核蛋白的毒性作用没有明显影响。7.10μmol/L FAC处理VM星形胶质细胞24 h后,促炎因子IL-1β、TNF-α的mRNA表达水平有升高的趋势,但无统计学意义(P﹥0.05),与100 nmol/L的α-突触核蛋白单体共孵育VM星形胶质细胞24 h后,可诱导α-突触核蛋白引起的促炎因子释放量增加,与对照组相比,IL-1β、TNF-αmRNA分别约升高11.92、4.95倍,差别有统计学意义(P<0.0001);与α-突触核蛋白组相比,IL-1β、TNF-αmRNA分别约升高26%、18%,差别有统计学意义(P<0.05)。100μmol/L FAC处理VM星形胶质细胞24 h后,促炎因子IL-1β、TNF-α的mRNA表达水平也有升高的趋势,且与对照组相比,TNF-αmRNA的升高有统计学意义(P<0.05),与100 nmol/L的α-突触核蛋白单体共孵育细胞24 h后,可诱导α-突触核蛋白引起的促炎因子表达量增加,与对照组相比,IL-1β、TNF-αmRNA分别约升高11.59、6.05倍,差别有统计学意义(P<0.0001);与α-突触核蛋白组相比,IL-1β、TNF-αmRNA分别约升高22%、44%,差别有统计学意义(P<0.01)。以上结果说明,原代培养的VM星形胶质细胞内铁水平升高增强细胞外α-突触核蛋白的毒性作用。8.100μmol/L FAC处理VM星形胶质细胞24 h后,CHOP、ATF-4、XBP-1s的表达有升高的趋势,且与对照组相比,ATF-4的升高有统计学意义(P<0.01),100 nmol/L的α-突触核蛋白与100μmol/L FAC共孵育VM星形胶质细胞24 h后,CHOP、ATF-4、XBP-1s的表达升高,与对照组相比,分别约升高1.61、1.93、2.26倍,差别有统计学意义(P<0.001);与α-突触核蛋白组相比,CHOP、ATF-4、XBP-1s分别约升高1.24、1.25、1.76倍,差别有统计学意义(P<0.05)。以上结果说明,原代培养的VM星形胶质细胞内铁水平升高增强细胞外α-突触核蛋白诱导的内质网应激。9.100 nmol/L、300 nmol/L的α-突触核蛋白单体处理VM神经元24 h后,与对照组相比ΔΨm分别下降12%、15%,差别有统计学意义(P<0.001)。100 nmol/L的α-突触核蛋白单体处理VM神经元24 h后,内质网应激相关蛋白CHOP、ATF-4、XBP-1s的表达升高,分别约为对照组的1.62、1.26、1.21倍,与对照组相比差别有统计学意义(P<0.05)。300 nmol/L的α-突触核蛋白组,CHOP、ATF-4、XBP-1s的表达升高,分别约为对照组的1.33、1.25、1.28倍,与对照组相比差别有统计学意义(P<0.05)。以上结果说明,α-突触核蛋白能够诱导VM神经元出现内质网应激。以上结果表明,细胞外的α-突触核蛋白单体能够引起C6胶质瘤细胞和VM星形胶质细胞促炎因子IL-1β、TNF-α的mRNA表达水平的升高,并且α-突触核蛋白纤维体也引起促炎因子的升高,但是升高水平低于α-突触核蛋白单体组,表明细胞外进入细胞内的α-突触核蛋白能够引起VM星形胶质细胞促炎因子表达水平增加,且α-突触核蛋白单体的毒性要高于α-突触核蛋白纤维体。进入到细胞内的α-突触核蛋白可以经UPS和ALP途径降解,且ALP在UPS被抑制的情况下激活更明显。细胞外的进入到细胞内的α-突触核蛋白可诱导C6胶质瘤细胞和VM星形胶质细胞内质网应激相关蛋白CHOP、ATF-4、XBP-1s的表达升高。细胞内高铁会进一步增强细胞外的α-突触核蛋白诱导VM星形胶质细胞促炎因子表达增加和内质网应激水平。本实验在星形胶质细胞中,探讨了铁沉积与细胞间传播的α-突触核蛋白之间的关系,为进一步阐明PD发病过程中铁与α-突触核蛋白相互作用的机制及干预措施,提供了新的实验依据。