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目的; 研究NMDA 受体及其亚单位NR2B 对体外培养神经干细胞存活、增殖的影响，检测NMDA 受体是否通过ERK1/2-pCREB 与CaMKIV-pCREB 信号通路发挥作用。
方法:
1、从新生1 天SD 大鼠海马分离培养细胞，血清诱导分化后行Nestin、β- tubulin Ⅲ、GFAP 免疫细胞化学反应，鉴定神经干细胞（Neural stem cells, NSCs）。
2、在传代培养的NSCs中，加入NR2B亚单位选择性拮抗剂Ro25-6981，使各组的终浓度分别为0.3μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、25μmol/L、100μmol/L，各组细胞继续培养3d，MTT法检测不同浓度Ro25-6981作用后NSCs的增殖率。
3、取传代培养的神经干细胞给予NMDA 受体激动剂NMDA（100μmol/L）、NMDA 受体非竞争性拮抗剂MK-801（30μmol/L）、NR2B 选择性拮抗剂Ro25-6981（0.5μmol/L）作用24h 后，流式细胞仪检测其总死亡率；传代的细胞用上述药物作用3d 后MTT 法检测NSCs 的增殖率，以观察NMDA 受体及其亚单位NR2B对NSCs 存活、增殖的影响。
4、为检测NSCs 上是否存在NMDA 受体介导的ERK1/2、CaMKIV 信号通路，将传代培养的细胞给予DMSO、NMDA、PD98059+NMDA（先加入100μmol/LERK1/2 抑制剂PD98059，1h 后加NMDA）、KN62+NMDA （先加入15μmol/LCaMKIV 抑制剂KN62，30 min 后加NMDA）作用6h 后，Western blot 法检测神经干细胞内pCREB 蛋白的表达水平。
5、将传代培养的细胞给予PD98059、PD98059+NMDA（先加入100μmol/LPD98059，1h 加NMDA）、KN62、KN62+NMDA（先加入15μmol/L KN62，30min 后加NMDA）作用24h 后，用流式细胞仪和MTT 法分别检测抑制了ERK1/2、CaMKIV 后NSCs 的总死亡率和增殖率，以此判断该信号通路对NSCs 存活、增殖的影响。
结果:
1、从新生1 天SD 大鼠海马分离培养的细胞nestin 反应阳性，加入血清诱导分化后，细胞可以分别分化成β- tubulin Ⅲ、GFAP 阳性的细胞。
2、不同浓度Ro25-6981 作用于NSCs 3d 后MTT 结果显示：0.5μmol/L 组与1μmol/L 组细胞增殖率均高于空白组（ P < 0.05 ），以0.5μmol/L 组增殖率最显著；25μmol/L 组与100μmol/L 组细胞出现中毒症状。
3、NMDA、MK-801、Ro25-6981 作用于NSCs 24h 后流式细胞仪检测结果显示：NMDA 与Ro25-6981 组细胞总死亡率低于对照组（ P < 0.05 ），MK-801组NSCs 的总死亡率高于对照组（ P < 0.05 ）。
4、NMDA、MK-801、Ro25-6981 作用于NSCs 3d 后MTT 结果显示：NMDA组与Ro25-6981 组细胞增殖率均高于对照组（ P < 0.05 ），MK-801 组细胞增殖率低于对照组（ P < 0.05 ）。
5、Western blot 法检测抑制ERK1/2、CaMKIV 后NSCs 内pCREB 的表达结果显示：各组NSCs 在43KD 处均有pCREB 阳性条带。NMDA 组pCREB 蛋白量表达增加（ P < 0.05 ）；分别抑制了ERK1/2 和CaMKIV 后再给予NMDA，NSCs内pCREB 蛋白量均显著低于对照组（ P < 0.05 ），但两组间差异无统计学意义（ P > 0.05 ）。
6、抑制ERK1/2、CaMKIV 后流式细胞仪与MTT 检测结果显示：单独抑制ERK1/2 和CaMKIV 后NSCs 的总死亡率高于对照组（ P < 0.05 ），细胞增殖率均低于对照组（ P < 0.05 ）；而分别抑制两条信号通路后再给予NMDA，NSCs的总死亡率降低但仍高于对照组（p<0.05）；其增殖率有所升高但仍低于对照组（p<0.05）。
结论:
1、一定剂量的NR2B亚单位拮抗剂Ro25-6981促进NSCs的存活及增殖，提示NR2B亚单位在调节NSCs的存活和增殖中可能起抑制作用。
2、NMDA受体可能通过ERK1/2-pCREB与CaMKIV-pCREB信号通路促进NSCs的存活和增殖。