论文部分内容阅读
目的：1.建立Caco-2细胞模型和人L-02肝细胞模型,并验证其稳定性。在此基础上建立了Caco-2/L-02肝细胞联合模型—-ADME/Tox并联测试体系。2.利用该体系考察吴茱萸水提物(WZY)体外吸收成分的吸收、代谢特征和肝毒性机理。方法：1. Caco-2细胞模型的建立和验证：参照本实验室前期的方法,通过跨膜电阻(TEER)的测定和Caco-2细胞形态观察,评价Caco-2细胞模型的紧密性与完整性。2.L-02肝细胞模型的建立和验证：按常规方法培养L-02肝细胞,通过细胞形态观察、台盼蓝染色测定肝细胞存活率及肝细胞培养上清液中白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)的含量测定,以评价L-02肝细胞模型的可靠性。3. Caco-2/L-02肝细胞联合模型及WZY的ADME/Tox研究：将Caco-2细胞模型与L-02肝细胞模型结合起来,建立ADME/Tox并联测试体系——Caco-2/L-02肝细胞联合模型,同时考察WZY在该模型上的吸收、代谢过程及毒性情况。在联合模型顶侧(AP侧)加入WZY,底侧(BL侧)收集代谢样品,用LC/MS法检测经过联合模型、Caco-2田胞和肝细胞模型吸收、代谢后的WZY成分变化；通过生化、ELISA测定BL侧的代谢样品,评价WZY代谢物对肝细胞的损伤作用。4.建立吴茱萸水提物(WZY)中吴茱萸碱、吴茱萸次碱的LC/MS含量测定方法。结果：1.Caco-2细胞模型：结果显示Caco-2细胞单层紧密性和完整性良好,表明该模型可用于研究药物的体外转运过程。2.L-02肝细胞模型：按常规培养L-02肝细胞,24小时后,肝细胞已经贴壁,培养3天的肝细胞镜下可见相互之间连接成片；存活率在95%-98%之间；L-02肝细胞培养3天,其尿素氮和白蛋白分泌功能达到高峰。因此,以第3天为给药时间。3.将可用的Caco-2细胞(Millicell膜)提出,轻放入种有L-02肝细胞的6孔板上,即得联合细胞模型。4.本文成功建立了WZY代谢物中两个生物碱有效成分的LC/MS测定方法。结果表明本方法的专属性、精密度、准确度及定量线性范围均符合要求,能同时快速准确测定WZY中吴茱萸碱(EVO)、吴茱萸次碱(RUT)的含量。结果显示,WZY经过联合模型吸收并代谢,联合模型组中EVO成分在1h、2h、24h的含量分别为2.53±1.60μg,4.57±0.03μg,15.86±0.06μg; RUT成分的含量分别3.56±1.49μg,5.87±0.09μg,18.70±0.21μg。Caco-2细胞模型中EVO成分在1h、2h、24h的含量分别为3.55±0.47μg,5.11±0.02μg,21.82±0.76μg;RUT成分的含量分别4.63±0.15μg,8.31±0.14μg,22.00±0.85μg。肝细胞模型中EVO成分在24h的含量为79.85±0.15RUT成分的含量为57.96±0.11WZY经联合模型吸收代谢2h、24h后,其中EVO、RUT两成分含量均低于Caco-2细胞模型组0<0.01)。生化测定结果显示,联合模型组AST(18.67±1.53)高于空白对照组①(14.00±1.41)。L-02肝细胞组AST(20.11±1.10)、ALT (16.33±3.21)、ALP (6.00±1.00)高于空白对照组②AST(13.00±3.00)、ALT(8.33±2.52)、ALP(3.33±1.15)。 ELISA测定结果显示,联合模型组CYP1A1(7.68±0.39)、CYP2C9(5.30+0.74)高于空白对照组①CYP1A1(6.70±0.03), CYP2C9(4.56-0.30)。L-02肝细胞组CYP1A1(3.96±0.11、CYP2C9(2.90±0.30)高于空白对照组②CYP1A1(3.53±0.19)、CYP2C9(2.42±0.03)。结论：1.吴茱萸水提物(WZY)中吴茱萸碱(EVO)、吴茱萸次碱(RUT)在体外均系吸收良好的成分(Papp>1×10-6cm/s)。2. EVO和RUT体外代谢研究表明二者均主要以原形方式代谢排泄。3.吴茱萸水提物(WZY)及其代谢物吴茱萸碱(EVO)、吴茱萸次碱(RUT)对肝细胞均具有一定损伤作用,其作用机制可能与诱导CYP1A1、CYP2C9有关。