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长期以来,神经病学领域都认为中枢神经系统成熟的神经元属于终末分化细胞,很难再进行分裂和增殖。因而中枢神经系统的损伤、变性导致的神经元丢失及神经元的损伤难以得到自我修复,神经功能的重建被视为不可能。科学家们对体外神经干细胞(NSCs)分离培养和增殖的成功,为中枢神经系统的再生和功能重建带来了新的希望。但目前已有的促进NSCs增殖和分化的方法都因其临床治疗可操作性不强而制约了临床转化应用。因此找到一种促进NSCs增殖和定向分化的药物可能为神经系统疾病的临床治疗提供新的可行途径。人参皂苷Rd(GSRd)是从人参和三七中提取的一种单体化合物,是它们主要活性成分之一。我们前期的临床和基础研究发现,GSRd具有明确的神经保护作用:治疗脑梗死安全有效、减少脑缺血模型大鼠梗死体积、减少神经元死亡、促进大鼠运动功能恢复等。但GSRd是否能促进成年哺乳动物脑内NSCs的神经发生从而发挥神经修复功能呢?目前还鲜有报道。为此本研究拟在在体和离体探究GSRd对NSCs增殖及分化的作用并初步探索可能的分子机制。第一部分GSRd对成年大鼠脑内海马齿状回神经发生影响的研究目的:探究GSRd对海马齿状回NSCs增殖分化的影响。方法:(1)30 mg/kg的GSRd腹腔注射到成年大鼠体内,每天注射1次,连续注射1周。GSRd给药后的第7 d和第14 d处死大鼠,将海马区切片,通过Brd U染色、DCX染色,观察GSRd对海马区NSCs增殖和新生神经元的影响。(2)GSRd给药后的第34 d处死大鼠,将海马区切片,进行Brd U/Neu N和Brd U/GFAP荧光双标记染色,观察GSRd对海马区NSCs分化的影响。结果:(1)GSRd干预后7 d,GSRd组的海马齿状回Brd U和DCX阳性细胞数明显增加(P<0.05);GSRd干预后14 d,GSRd组海马区Brd U和DCX阳性细胞的数目与对照组相比无明显差异。(2)GSRd组的Brd U+/Neu N+双标记细胞与对照组相比,数量明显增加(P<0.05)。但两组Brd U+/Neu N+双标记细胞占总Brd U+细胞百分数无统计学差异。另外,对GSRd组和对照组进行Brd U/GFAP免疫荧光双标记染色,两组均没有观察到Brd U+/GFAP+双标记细胞。结论:GSRd显著增加海马齿状回NSCs及新生神经元的数量,但对NSCs的分化并无明显作用。第二部分GSRd对培养NSCs增殖分化影响的研究目的:探究GSRd对体外培养NSCs增殖分化的影响。方法:(1)分离培养胎鼠NSCs并进行神经球鉴定和分化鉴定。(2)体外培养NSCs,经过不同浓度GSRd干预后,观察神经球的数量和大小的变化;CCK-8法、Brd U免疫荧光染色分别观察GSRd对NSCs存活和增殖的影响。(3)体外培养NSCs,经过GSRd干预后,分别进行Tuj-1、GFAP和CNPase免疫荧光染色,观察GSRd对NSCs分化的影响。结果:(1)对体外培养的NSCs进行Nestin、Ki67免疫细胞化学染色,结果显示被染色的细胞呈Nestin阳性和Ki67阳性反应。Tuj-1、GFAP、CNPase免疫细胞化学染色结果显示,所培养的NSCs可以定向分化为神经元、星形胶质细胞以及少突胶质细胞,具有多向分化的潜能。(2)与对照组相比,GSRd组神经球的数目和直径明显增加(P<0.05);CCK-8法、Brd U免疫荧光染色结果显示,GSRd可明显促进体外培养的NSCs的存活和增殖(P<0.05)。(3)体外培养的NSCs,GSRd处理组Tuj-1、GFAP和CNPase阳性细胞百分率与对照组相比无明显差异。结论:GSRd可促进体外培养NSCs存活和增殖,对体外培养NSCs的分化无影响。第三部分GSRd促进神经干细胞神经发生机制的研究目的:探究GSRd促进神经干细胞神经发生可能的分子机制。方法:(1)Western Blot测定GSRd干预后的NSCs中Akt、p-Akt、ERK、p-ERK、PKC、p-PKC蛋白表达水平;(2)Western Blot测定PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002、MAPK/ERK1/2信号通路抑制剂PD98059干预下经GSRd作用的NSCs中Akt、p-Akt、ERK、p-ERK蛋白表达;(3)CCK-8法、Brd U免疫荧光染色分别观察LY294002和PD98059干预下经GSRd作用的NSCs的存活和增殖。结果:(1)与对照组相比,GSRd组p-Akt、p-ERK蛋白表达明显增加(P<0.05),但Akt、ERK、PKC、p-PKC蛋白表达与对照组相比无明显差异。(2)与GSRd组相比,LY294002干预组和PD98059干预组p-Akt、p-ERK蛋白表达降低(P<0.05)。(3)LY294002和PD98059可明显减弱GSRd干预的NSCs的存活和增殖(P<0.05)。结论:GSRd可能通过PI3K/Akt和MAPK/ERK1/2信号通路调控NSCs的神经发生。