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研究背景和目的:糖尿病(diabetesmellitus,DM)大血管并发症(如冠状动脉疾病、周围血管疾病、中风)是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者的主要死亡原因,超过DM相关死亡的50%。DM大血管并发症的特点是加速的动脉粥样硬化的发生和发展。DM和非DM个体动脉粥样硬化在病理解剖上是相似的,但DM病变发生更早,波及范围更广泛。越来越多的证据表明,血管内皮功能障碍和细胞凋亡是DM患者动脉粥样硬化发生和发展中最早和最关键的始动因素。DM患者血管内皮细胞(endothelial cells,ECs)暴露于高血糖和高脂环境从而发生凋亡并从内膜脱落,触发动脉粥样硬化发生,导致动脉粥样硬化进展和大血管并发症的发生、发展。虽然ECs凋亡和动脉粥样硬化之间的因果关系已形成共识,但其潜在机制仍不完全清楚。因此,阐明内皮细胞凋亡信号通路,有助于我们寻找减少DM患者ECs凋亡和动脉粥样硬化发生、发展的新的治疗靶点。E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)是一种小分子糖蛋白,主要表达于分化成熟的组织细胞,在未分化的组织细胞低表达甚至不表达。有研究报道,在分化成熟型血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)中CREG大量表达,通过抑制VSMCs增殖、迁移并诱导其分化来维持VSMCs的稳态,提示CREG是一个诱导细胞分化的内稳态调控因子。本实验室前期一系列研究结果提示:CREG在正常血管ECs中存在高表达,小鼠主动脉和人冠状动脉动脉粥样硬化斑块部位ECs中CREG的表达显著减少;通过皮下埋泵方式给予高脂喂养的载脂蛋白E基因敲除小鼠外源性的CREG蛋白,则可明显减轻动脉粥样硬化斑块。我们进一步研究发现,CREG可能通过下述机制保护血管ECs:①通过不同的信号通路促进人脐静脉内皮细胞(humanumbilical vein endothelial cells,HUVECs)的增殖和迁移;②在猪冠状动脉损伤模型中,给予CREG蛋白涂层支架可促进冠状动脉内皮修复;③通过抑制NF-kappaB的激活和抑制肿瘤坏死因子α(等细胞因子刺激引起的ECs超渗透性炎症反应;④通过VEGF/PI3K/Akt通路抑制凋亡诱导剂引起的ECs凋亡等。综上所述,CREG是对抗ECs凋亡、保护血管ECs完整性的重要调控因子。除了对ECs的保护作用,CREG基因还具有抑制VSMC和骨髓干细胞凋亡的作用。然而,CREG在DM患者ECs凋亡中的作用尚不清楚,结合本实验室前期研究,我们拟探讨动脉粥样硬化病理因素高糖高脂刺激下CREG基因表达与ECs凋亡变化以及引起CREG表达变化的上游调控机制。研究方法:1.经沈阳军区总医院医学伦理委员会批准,入选DM合并下肢动脉硬化需进行截肢手术的病人(DM组)及因交通事故等外伤需截肢的非DM非动脉粥样硬化患者(对照组)。分离截肢部位动脉,通过HE染色、免疫荧光染色及原位末端标记法(terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL)观察DM组及对照组血管ECs凋亡及人CREG(human CREG,hCREG)基因表达情况,并通过Western blot检测两组血管中hCREG表达及凋亡执行分子Cleaved caspase-3的表达情况。原代培养HUVECs,给予不同浓度(5.5mM、11.1mM、25mM和33.3mM)D-葡萄糖(D-glucose,D-GLU)及不同浓度(0.2mM、0.3mM、0.4mM)棕榈酸(palmitate,PA)处理24h,模拟T2DM细胞模型,应用Annexin V-FITC/PI和TUNEL染色检测细胞调亡情况,Western blot及实时荧光定量多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测 hCREG 基因及 Cleaved caspase-3 表达,并明确诱导 HUVECs 凋亡的最佳高糖高脂浓度。构建低表达和过表达hCREG基因的HUVECs,筛选稳定转染细胞并建立细胞系,分别给予高糖高脂刺激24h,通过Annexin V-FITC/PI、TUNEL染色及Western blot检测细胞凋亡及hCREG、Cleaved caspase-3表达情况,进一步证实高糖高脂环境下HUVECs中hCREG基因表达与细胞凋亡的关系。2.通过生物信息学(NCBI的GenBank)初步预测hCREG启动子区位置,构建包含hCREG基因启动子区不同截短片段的双荧光素酶报告基因及增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)报告基因,通过检测荧光素酶活性及观察绿色荧光强度确定hCREG基因核心启动子区位置。再结合转录因子(transcription factor,TF)基因芯片筛查、生物信息学预测(Promo在线预测软件)、染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)等实验,确定hCREG核心启动子区可能结合的TF。3.缺失突变TF可能与hCREG基因结合的位点,构建含缺失突变位点的双荧光素酶报告基因,与未突变的报告基因相比活性有明显差异的位点即为对hCREG起关键调控作用的TF结合位点。提取DM患者动脉粥样硬化血管与正常对照血管RNA及蛋白,通过定量PCR和Western blot检测该TF的表达,明确与hCREG表达的相关性。构建过表达该TF的pcDNA3.1(+)载体,通过Annexin V-FITC/PI、TUNEL染色及Western blot检测过表达该TF对高糖高脂诱导的HUVECs中hCREG表达及细胞凋亡的影响。明确该TF对高糖高脂环境下hCREG基因表达的调控作用。研究结果:1.DM患者血管ECs和高糖高脂刺激下的HUVECs中hCREG基因表达减少,ECs凋亡增加。HE染色可见,DM血管内膜明显增厚,斑块突入管腔;免疫荧光染色显示,DM组血管内皮中hCREG基因表达较对照组血管明显减少,TUNEL染色显示DM组血管比对照组血管ECs凋亡明显增多。Western blot检测可见DM血管hCREG表达明显减少而Cleaved caspase-3的表达明显增多,提示hCREG可能参与了 DM患者血管ECs凋亡的过程。首先确定25mM的D-GLU为最佳高糖刺激浓度,可使HUVECs凋亡显著增多但细胞死亡无明显增多。Annexin V-FITC/PI和TUNEL染色检测显示高糖(25mM D-GLU)加不同浓度高脂(0.2、0.3、0.4mM PA)刺激24h后随PA浓度增高,HUVECs凋亡呈剂量依赖性增加。Western blot及定量PCR结果显示hCREG基因表达随高脂浓度增高呈剂量依赖性减少,而Cleaved caspase-3明显增多,即凋亡增加。此部分实验显示高糖高脂刺激可引起HUVECs中hCREG基因表达减少,细胞凋亡增加。为进一步明确hCREG基因在高糖高脂诱导的HUVECs凋亡中的作用,我们构建了低表达和过表达hCREG基因的HUVECs,筛选稳定转染的细胞并建立细胞系,分别给予高糖高脂刺激24h,通过Western blot、定量PCR、Annexin V-FITC/PI和TUNEL染色检测,结果显示过表达hCREG可以明显减轻高糖高脂诱导的HUVECs凋亡,而低表达hCREG可加重HUVECs凋亡。提示hCREG是高糖高脂条件下血管ECs凋亡增加的直接原因。以上组织学和细胞学实验均表明,高糖高脂环境下通过下调hCREG基因表达可以引起HUVECs凋亡增加。调控基因表达最关键的环节是转录水平的调控,其中顺式作用元件(主要指启动子)与反式作用因子(如TF)是两个基本的转录调控元件。目前hCREG基因核心启动子区定位和调控其表达的TF尚不清楚。2.hCREG基因核心启动子区的确立和关键TF的筛选通过生物学(NCBI的GenBank)预测hCREG启动子区位于转录起始位点(定义为+1)上游约2000bp范围内,构建包含hCREG基因启动子区不同截短片段的双荧光素酶报告基因 pGL4.12-hCREG-2003(-1925/+78)、pGL4.12-hCREG-945(-867/+78)、pGL4.12-hCREG-586(-508/+78)、pGL4.12-hCREG-478(-400/+78)和pGL4.12-hCREG-358(-280/+78),将这些质粒分别与参照质粒pGL4.73共转染于人胚胎肾上皮293T和HUVECs48h,按照双荧光素报告基因系统操作说明书,检测荧火虫荧光素酶(Firefly luciferase,Fluc)与海肾素荧光素酶活性(Renila luciferase,Rluc)。首次确定了 hCREG基因高水平转录的最小核心启动子区域位于hCREG-568(-508/+78)片段;而 hCREG-586(-508/+78)和 hCREG-358(-280/+78)之间荧光素酶活性出现较大落差,提示-508/-281片段在hCREG基因表达中起关键调控作用。另外分别构建pEGFP1绿色荧光报告基因pEGFP1-hCREG-2003、pEGFP1-hCREG-945、pEGFP1-hCREG-586、pEGFP1-hCREG-478 和 pEGFP1-hCREG-358 系列报告基因载体,转染293T细胞后直接在荧光显微镜下观察绿色荧光转染效率和强度,得到相似结果。基于以上结果,合成hCREG基因-508/+78的DNA片段,通过TF基因芯片筛查、生物信息学预测(Promo在线预测软件)、ChIP实验等确定了核心启动子区域hCREG-586(-508/-281)最有可能结合的TF有GATA1和ETS1。3.过表达GATA1可以通过上调hCREG表达而减少高糖高脂诱导的HUVECs凋亡。通过缺失突变方法确定了对hCREG起关键调控作用的TF为GATA1,其与hCREG的结合位点位于-297/-292。将此位点缺失突变后,hCREG基因转录活性降低约83.3%。而GATA1 C-467/-462)及ETS1(-312/-306)缺失突变前后hCREG基因转录活性无明显变化。提取DM患者动脉粥样硬化血管与对照血管,通过定量PCR和Western blot检测发现DM患者血管中GATA1明显减少,与hCREG基因表达成正相关。为了更进一步验证GATA1对hCREG的调控作用,构建了 pcDNA3.1(+)过表达GATA1稳定转染的HUVECs细胞模型,给予高糖高脂刺激24h,AnnexinV-FITC/PI和TUNEL染色结果发现,过表达GATA1后高糖高脂诱导的HUVECs凋亡减少47%和21%,均有显著差异。定量PCR和Western blot检测结果则表明,过表达GATA1后hCREG表达上调2～4倍。本部分的研究结果提示GATA1是上调hCREG表达的关键上游调控分子,GATA1过表达可以通过上调hCREG表达,对抗高糖高脂诱导的血管ECs凋亡。结论:综上所述,本研究发现:①T2DM患者动脉粥样硬化血管比非DM患者血管内皮细胞中hCREG基因表达减少而细胞凋亡明显增多;②高糖(25mM D-GLU)加不同浓度高脂(0.2、0.3、0.4mM PA)刺激24h后,随高脂浓度增高HUVECs凋亡呈剂量依赖性增多,hCREG基因表达呈剂量依赖性减少。③过表达hCREG基因可以使高糖高脂诱导的HUVECs凋亡减少,而低表达hCREG基因可以使高糖高脂诱导的HUVECs凋亡进一步增加;④研究表明,hCREG基因关键启动子区位于-508/+78,GATA1可能与该区内-297/-292位点结合,将此位点缺失突变后,CREG基因转录活性降低约83.3%;⑤过表达GATA1可上调CREG基因表达,同时抑制高糖高脂诱导的HUVECs凋亡。本课题初步揭示了GATA1可通过上调CREG基因表达抑制高糖高脂诱导的HUVECs凋亡。提示hCREG基因可能是预防DM血管并发症的一个潜在的治疗靶点。