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基因打靶技术是解决转基因动物中外源基因不稳定表达和遗传问题的主要方法之一，但基因打靶所依赖的同源重组是10-5～10-6的低概率事件。近年来，本研究小组建立了一种以动物rRNA基因间的内部转录间隔序列为靶位点的多位点基因打靶技术，这种技术能将外源基因定点整合到靶位点的概率提高到10-3～10-4。但是，这种技术还不能达到更高效的基因打靶研究与应用要求。据最近的一些报道，一种新的技术，即锌指蛋白核酸酶介导的基因整合技术能将基因定点整合的效率提高到更高的数量级。本研究小组拟将锌指蛋白核酸酶与多位点基因打靶技术结合以建立高效的基因打靶技术，本论文为该项目的前期工作。
本论文设计、表达了四个锌指核酸酶，将其用于切断奶牛基因组中的rRNA基因家族的ITS1，造成双链断裂，以此提高多位点基因打靶的效率，为后续动物体内基因打靶研究奠定基础。研究内容和研究结果如下：
(1)在奶牛rRNA基因家族ITS1序列中找到两个合适的9bp长的序列(中间间隔6个碱基)为锌指蛋白识别位点，每个位点分别设计两个三联体锌指蛋白，命名为ZFPA、ZFPB、ZFPC、ZFPD。ZFPA、ZFPB识别序列为5’-GCG GAC GGG-3’，ZFPC、ZFPD识别序列为5’-GTC GGG GGC-3’。获得四个三联体锌指蛋白的DNA理论序列。
(2)每个锌指蛋白序列设计8条首尾互补引物，进行重叠延伸PCR得到编码全长锌指蛋白的DNA序列，构建重组质粒pET28a-ZFP，转化大肠杆菌RossettaTM(DE3)，实现带组氨酸标签的锌指融合蛋白的表达，优化了重组质粒表达的条件，并获得纯化的锌指蛋白。
(3)设计18条引物拼接得到Fok I切割结构域序列及接头序列，再将Fok I的切割结构域分别与四个锌指蛋白序列采用PCR拼接，构建重组质粒pET28a-ZFN，转化到大肠杆菌RossettaTM(DE3)，实现带组氨酸标签的锌指核酸酶融合蛋白的表达，优化了重组质粒表达的条件，并获得纯化的锌指核酸酶。
(4)优化了重叠延伸PCR技术的实验过程，如：最合适的引物长度、最佳PCR反应循环数、合成进度合理的分步控制等。特别是对于长序列片断，可以有效减少序列变异几率，提高合成效率。