【摘 要】
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背景与目的:肝细胞肝癌是危害人类健康的常见恶性肿瘤,在我国具有较高的发病率和死亡率。三氧化二砷（Arsenic trioxide,ATO）对白血病细胞和实体肿瘤细胞具有很高的杀伤活性,在临床白血病及实体肿瘤的治疗中均获得了良好效果,但其毒副作用限制了临床应用。小白菊内酯（Parthenolide,PTL）是第一个靶向肿瘤干细胞且对正常细胞无毒性作用的天然倍半萜内酯活性化合物,具有化疗药物增敏和特异
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背景与目的:肝细胞肝癌是危害人类健康的常见恶性肿瘤,在我国具有较高的发病率和死亡率。三氧化二砷（Arsenic trioxide,ATO）对白血病细胞和实体肿瘤细胞具有很高的杀伤活性,在临床白血病及实体肿瘤的治疗中均获得了良好效果,但其毒副作用限制了临床应用。小白菊内酯（Parthenolide,PTL）是第一个靶向肿瘤干细胞且对正常细胞无毒性作用的天然倍半萜内酯活性化合物,具有化疗药物增敏和特异性清除肿瘤干细胞的效应。联合应用PTL可否增敏ATO对肝癌细胞的杀伤效应及可能的细胞分子机制尚不清楚。本论文采用恶性程度及转移潜能不同的肝癌细胞模型和动物模型,比较研究ATO和PTL单独或联合作用对肝癌细胞的杀伤活性,以及诱导肝癌细胞凋亡和自噬的作用,探讨PTL和ATO对肝癌细胞联合作用的细胞分子机制,为PTL和ATO联合应用于肝癌的临床治疗提供实验依据。方法:以Hep G2细胞、MHCC 97H细胞和Huh7细胞为人肝癌细胞模型、永生化肝细胞L02细胞为正常肝细胞模型,小鼠肝癌H22细胞构建肝癌体内移植瘤模型,采用MTT比色法检测细胞增殖活性,Annexin V/PI双荧光染色检测凋亡;荧光探针标记法检测细胞内线粒体膜电位和活性氧水平;Western blot和免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）技术检测细胞凋亡和自噬相关信号通路蛋白表达、修饰及蛋白相互作用;CRISPR-Cas9技术构建基因敲除细胞模型;构建小鼠皮下移植瘤模型研究体内抗肿瘤效应。结果:PTL增强ATO对Hep G2细胞、MHCC 97H细胞和Huh7细胞等肝癌细胞的增殖抑制作用,促进肝癌细胞的凋亡,细胞周期被阻滞在G2/M期,细胞表面CD133表达降低,细胞干性和自我更新能力受到抑制。PTL和ATO联合处理的肝癌细胞去泛素化酶USP7活性被抑制,其底物E3泛素连接酶HUWE1含量明显降低,HUWE1底物P53降解受到抑制、含量增高,USP7和HUWE1间的相互作用减弱。提示USP7-HUWE1-P53轴介导调控PTL增强肝癌细胞对ATO敏感性的联合效应。PTL和ATO联合作用可诱发肝癌细胞的自噬活性,细胞PI3K/AKT/m TOR信号通路受到抑制。自噬抑制剂氯喹（Chloroquine,CQ）和自噬关键基因Atg5敲除可显著增加PTL和ATO联合处理肝癌细胞活化Caspase3的含量,增加肝癌细胞对ATO/PTL的敏感性,细胞凋亡增加。提示ATO和PTL作用早期会诱发肝癌细胞自噬,PTL协同ATO通过PI3K/AKT/m TOR信号通路调控肝癌细胞的自噬和细胞凋亡。体内动物实验显示,PTL和ATO单独或联合作用后,小鼠H22肝癌的生长速度显著减低,肿瘤体积和重量明显降低,联合应用CQ可增强PTL/ATO对H22肝癌生长的抑制效应。结论:1小白菊内酯联合应用三氧化二砷显著抑制Hep G2、MHCC 97H、Huh7、H22等肝癌细胞的增殖活性,降低细胞自我更新能力和促进细胞凋亡。小白菊内酯通过USP7-HUWE1-P53轴介导增强肝癌细胞对三氧化二砷的敏感性。2小白菊内酯联合三氧化二砷通过抑制PI3K/AKT/m TOR通路诱发肝癌细胞的自噬反应,抑制肝癌细胞的自噬活性可明显增强三氧化二砷对肝癌细胞的杀伤效应。3小白菊内酯和三氧化二砷在体内具有显著的抗肝癌作用,抑制自噬活性可加强小白菊内酯和三氧化二砷的联合抗肿瘤效应。
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