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ZBTB蛋白是C2H2型锌指蛋白家族的重要成员,作为转录因子调节下游靶基因的转录活性,广泛的参与基因的转录调控,细胞增殖、分化及凋亡等生命活动。本实验室通过RT-PCR从胃癌细胞AGS中克隆到一个ZBTB家族基因ZBTB8A(Zinc finger and BTB domain containing8A)。目前未见关于ZBTB8A的文献报道,故本文对该基因展开了初步的探索。
生物信息学分析表明,ZBTB8A(NM001040441)位于第1号染色体,定位在1p35.1。该基因含有1326bp开放阅读框,编码一个由441个氨基酸组成,分子量为50KD的蛋白。SMART分析表明ZBTB8A蛋白N端含有一个BTB结构域,C端含有两个典型的C2H2型锌指基序。同源性分析显示该蛋白BTB结构域和多个ZBTB家族成员的BTB结构域是高度同源的。
通过构建绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-ZBTB8A进行亚细胞定位分析,结果显示ZBTBSA定位于细胞核且呈斑点状分布。为鉴定ZBTB8A蛋白的不同结构域对定位的影响,构建了一系列截短型ZBTB8A与绿色荧光蛋白融合表达的重组质粒,转染HeLa细胞进行亚细胞定位分析。结果显示锌指结构域对ZBTB8A蛋白的细胞核定位起关键作用,而BTB结构域对于ZBTB8A在细胞核内的斑点状定位是必需的。
大量研究表明ZBTB蛋白作为转录因子参与细胞内多种信号通路的转导。因此,本文首先应用pGa145tkLuc报告载体分析ZBTB8A的转录激活／抑制作用,数据表明ZBTB8A是一个转录抑制因子。其次利用一系列信号通路报告载体,通过双荧光素酶报告基因检测系统分析ZBTB8A对AP1,NFAT,MYC,Rb,HSE,CRE,AP1(PMA),GRE和NF-κB相关信号通路的转录调控作用。结果表明ZBTB8A蛋白明显抑制CRE的转录活性,且该抑制作用具有剂量依赖性。进一步对ZBTB8A的不同功能区段的转录调控作用进行分析,数据表明BTB结构域及锌指结构域在ZBTB8A对CRE的转录抑制中都是非常重要的,缺失其中任一结构域都会显著降低该抑制作用。pCRE-Luc质粒含有CRE元件,用来监控CRE介导的信号通路,说明ZBTB8A可能在CRE介导的信号通路中发挥一定的抑制作用从而调控细胞的一系列功能。
为进一步开展对ZBTB8A功能的研究,我们设计并合成四个ZBTB8A干扰载体。应用半定量PCR鉴定出有效的ZBTB8A干扰载体,并通过G418筛选获得高表达及低表达ZBTB8A的AGS稳定细胞株。本实验的相关工作为深入研究ZBTB8A在胃癌细胞AGS中的生物学作用,确定ZBTBSA在肿瘤细胞中的功能打下了基础。