论文部分内容阅读
铁皮石斛(Dendrobium officinale kimura et Migo)属于兰科多年生草本附生植物,具有很高的药用和观赏价值。多分布在我国南方地区,对环境要求较高。在其生长过程中,水分是一个重要的限制性生态因子,水分缺失不仅会影响其产量,更会影响药用成分产生。本文以半年生铁皮石斛顶端第一叶片为材料,研究干旱胁迫下铁皮石斛的生理生化指标及石斛多糖含量的变化,并用甲基化敏感扩增多态性技术(MSAP)研究干旱胁迫前后甲基化水平变化,进一步探讨铁皮石斛响应干旱胁迫的机制。主要研究结果如下:(1)干旱胁迫下铁皮石斛的保护酶超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)呈先增大后减少的趋势;光合参数Ft和Qy呈下降的趋势;渗透性物质可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸同样呈先增大后减少的趋势;膜脂过氧化指标丙二醛含量在0-18 d时增幅不明显,18-24 d时大量增加。石斛多糖是铁皮石斛中最主要的药用成分,是检测铁皮石斛品质优劣的重要指标。在干旱胁迫下,铁皮石斛的石斛多糖含量呈上升的趋势,但是其含量始终小于对照组。(2)采用56对引物进行MSAP反应,共扩增383个带型,平均每对引物扩增7.98个片段。DNA甲基化总水平为31.4%-40.4%,全甲基化变化水平为11.9%-12.4%。一共筛选到了100-300 bp左右的片段52条,对其中变化稳定的16条片段进行回收、克隆和测序,经过Genbank在线Blast与铁皮石斛基因组本地数据库Blast比对,发现这些差异片段和一种结构域(CBS结构域)、两种酶(ATP合酶和乙醇脱氢酶)、三种转录因子(GRAS转录因子、bHLH转录因子和锌指蛋白转录因子)有很高的同源性,另外有2两个序列没有注释信息。(3)进一步选取Sequence1(与ATP合酶同源)、Sequence5(与bHLH转录因子同源)和Sequence12(未知基因)三个基因进行荧光定量PCR(Fluorogenic quantitative PCR,qPCR)表达验证,它们分别代表超甲基化(Hypermethylation)、去甲基化(Demethylation)和超甲基化类型。荧光定量PCR结果显示,Sequence1和Sequence12的甲基化类型和实验结果一致,Sequence5结果相反。