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斜纹夜蛾(Spodoptera litura)是重要的农业害虫,危害99科100多种植物,每年给我国农业生产造成严重损失,因此研发高效的斜纹夜蛾防治方法一直是科研工作者孜孜以求的目标。传统化学防治方法会引起斜纹夜蛾产生严重抗性,且农药残留问题也一直是危害人类健康的潜在因素,所以迫切需要开发无公害防治斜纹夜蛾的方法。近年来,随着基因组数据积累及基因编辑技术的发展,非模式昆虫的基因功能解析以及靶标基因的筛选成为可能,为更好地开发害虫生物防治方法提供了强有力的技术支撑。本研究旨在利用基因编辑技术研究斜纹夜蛾性别决定通路关键基因,进而开发出能够防治斜纹夜蛾的有效方案。为达成这一目标进行了如下研究:第一,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建斜纹夜蛾基因组编辑平台,为研究斜纹夜蛾基因功能奠定基础;第二,寻找斜纹夜蛾性别决定通路和生殖调控方面关键基因,利用斜纹夜蛾基因组编辑平台研究靶标基因功能;第三,构建斜纹夜蛾害虫防治遗传调控品系。相关研究成果可为斜纹夜蛾害虫防治提供理论基础和解决方案,具体研究内容和结果如下:1.基于CRISPR/Cas9技术的斜纹夜蛾基因组编辑平台的构建CRISPR/Cas9技术是目前基因组编辑体系中应用广泛、效率较高的技术之一。本研究以黑色素合成通路Ebony基因为靶标基因,利用体外合成Cas9 mRNA和Ebony基因特异的sgRNA,通过斜纹夜蛾胚胎显微注射平台,从而构建斜纹夜蛾基因组编辑体系。研究结果显示Ebony突变体在蛹期和成虫期表现出身体着色加深、蛹壳黑化等表型,成虫身体各器官颜色明显较野生型有所加深。DNA提取以及PCR测序证明突变体在基因组序列Ebony靶点附近存在碱基片段缺失,由此证明本实验成功敲除了Ebony基因,完成斜纹夜蛾CRISPR/Cas9基因组编辑体系构建和优化。2.斜纹夜蛾性别决定通路关键基因Masc和Doublesex功能研究性别决定是雌雄昆虫特征分化的基础,也是害虫种群调控的重要候选基因。本研究以非模式昆虫斜纹夜蛾为研究对象,利用本实验室构建的斜纹夜蛾CRISPR/Cas9基因组编辑平台,研究了性别决定通路关键基因Masc和Doublesex在鳞翅目害虫斜纹夜蛾中的具体功能。利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术敲除了斜纹夜蛾Masc和Doublesex基因,阐明了SlMasc和SlDoublesex基因在斜纹夜蛾雌雄性别决定过程中具有重要功能。在家蚕BmN细胞中过表达SlMasc导致雄性特异性Bmdsx~M剪接体的出现,SlMasc突变导致雄性胚胎致死和雄性不育。SlDoublesex突变导致雌雄外生殖器畸形、精子发育异常,以及雌雄成虫不育。由此成功构建了斜纹夜蛾Masc雄性不育和致死品系以及Doublesex雌雄不育品系,为更好地防治斜纹夜蛾提供了靶标基因,奠定了理论基础。3.基于基因组编辑技术的斜纹夜蛾雌雄特异性不育品系的构建研究昆虫的生殖能力是其繁衍后代、扩大种群的关键。利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,在个体水平上研究了斜纹夜蛾Ser2和Osp基因的功能。研究发现SlSer2和SlOsp基因分别在雄性和雌性成虫中特异性表达;体内敲除SlSer2基因导致成虫雄性不育,但不影响雌性生殖传代;qPCR检测发现,SlSer2功能缺失导致肌动蛋白、结构蛋白和相关酶等家族基因下调,证明SlSer2是重要精液蛋白成分,参与斜纹夜蛾受精作用过程;破坏SlOsp基因功能导致雌性成虫不育,突变体产卵率和孵化率显著性低于野生型,且SlOsp基因功能缺失不影响雄性生殖能力。这些研究证实了斜纹夜蛾生殖调控基因Ser2和Osp的功能,进而构建了斜纹夜蛾Ser2成虫雄性不育品系和Osp成虫雌性不育品系,为害虫防治奠定了理论基础。