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研究目的：
本课题以高表达TCP1蛋白的HL-60/ADR白血病耐药细胞为研究模型，观察敲减TCP1后对HL-60/ADR细胞增殖、周期、凋亡及耐药性的影响，并在蛋白质和基因水平探索其分子机制,为白血病化疗耐药治疗提供新参考。
研究方法：
1.探索TCP1与HL-60/ADR细胞耐药的相关性：MTT法检测HL-60/ADR和HL-60细胞的耐药性；流式细胞术及倒置荧光显微镜观察阿霉素在HL-60/ADR和HL-60细胞中的积累；Western blot检测TCP1在HL-60/ADR和HL-60细胞中的表达；
2.构建pLKO.1puro-TCP1-shRNA重组的慢病毒表达质粒载体，通过慢病毒包装、感染、筛选，获得稳定沉默TCP1基因的HL-60/ADR细胞株。
3.观察敲减TCP1后对HL-60/ADR细胞增殖、周期、凋亡及阿霉素敏感性的影响：MTT法检测TCP1基因沉默对HL-60/ADR细胞增殖的影响；克隆形成实验检测细胞克隆形成能力的变化；流式细胞术检测TCP1基因敲减后HL-60/ADR细胞凋亡及周期的变化；MTT法及流式细胞术等检测敲减TCP1基因后HL-60/ADR细胞对阿霉素的敏感性影响。
4.Real time PCR及Western blot检测增殖、凋亡、周期相关蛋白（如c-Myc,Bcl-2，Bax，cleaved caspase3，CyclinE，CDK2，CDK6等）,PI3K/AKT/P27信号通路蛋白及耐药相关蛋白（如BCRP、GST-pi和MRP1等）的mRNA水平或蛋白水平变化。
研究结果：
1.HL-60/ADR细胞的半数抑制浓度（IC50）是HL-60细胞的200倍左右符合我们对耐药株的要求，与耐药性相一致的是HL-60细胞对阿霉素的吸收较HL-60/ADR细胞多且快；TCP1在HL-60/ADR细胞中的表达较HL-60细胞高，且在阿霉素处理下，TCP1在HL-60细胞及HL-60/ADR细胞中的表达与阿霉素的剂量和作用时间有相关性，TCP1可能与HL-60/ADR细胞耐药相关。
2.成功构建pLKO.1puro-TCP1-shRNA重组的慢病毒表达质粒载体并筛选出稳定沉默TCP1的HL-60/ADR细胞株，qRT-PCR及Western blot结果显示干扰组细胞TCP1mRNA和蛋白水平表达均明显下调,相较于对照组,干扰组TCP1mRNA含量下调82.18%。
3.敲减TCP1基因后HL-60/ADR细胞的生物学行为受到影响：MTT结果显示TCP1沉默后可以抑制细胞增殖；克隆形成实验发现,抑制TCP1表达HL-60/ADR细胞的克隆形成能力受到抑制，克隆形成抑制率为75.01%；流式细胞仪检测细胞周期结果表明,TCP1基因沉默后，G0/G1期细胞比例增多，S期和G2/M期细胞比例降低，细胞周期阻滞在G0/G1期；细胞凋亡检测结果显示，与对照组（NC组）相比，干扰组（KD组）细胞凋亡率显著升高；MTT法及流式细胞术检测细胞对阿霉素的敏感性，发现TCP1敲减后HL-60/ADR细胞对阿霉素的敏感性提高。
4.Real time PCR及Western blot检测了增殖、凋亡和周期相关蛋白，发现增殖、凋亡相关蛋白发生与表型相一致的变化，如c-Myc、p-Akt、抗凋亡蛋白Bcl-2下调，p27、促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase3、cleaved caspase9上调，周期相关蛋白CyclinE、CyclinD1、CDK2和CDK6下调；耐药相关蛋白BCRP、GST-pi、Topo2a和MRP1等的蛋白水平及mRNA水平均下调。
研究结论：
1.沉默TCP1基因后可抑制HL-60/ADR细胞增殖、延缓细胞周期进程及促进细胞凋亡。
2.干扰TCP1基因后可提高HL-60/ADR细胞对阿霉素的敏感性。
3.TCP1基因沉默后PI3K/AKT/P27信号通路受到抑制，推测PI3K/AKT/P27信号通路可能与TCP1基因对HL-60/ADR细胞生物学行为的调控相关。
本课题以高表达TCP1蛋白的HL-60/ADR白血病耐药细胞为研究模型，观察敲减TCP1后对HL-60/ADR细胞增殖、周期、凋亡及耐药性的影响，并在蛋白质和基因水平探索其分子机制,为白血病化疗耐药治疗提供新参考。
研究方法：
1.探索TCP1与HL-60/ADR细胞耐药的相关性：MTT法检测HL-60/ADR和HL-60细胞的耐药性；流式细胞术及倒置荧光显微镜观察阿霉素在HL-60/ADR和HL-60细胞中的积累；Western blot检测TCP1在HL-60/ADR和HL-60细胞中的表达；
2.构建pLKO.1puro-TCP1-shRNA重组的慢病毒表达质粒载体，通过慢病毒包装、感染、筛选，获得稳定沉默TCP1基因的HL-60/ADR细胞株。
3.观察敲减TCP1后对HL-60/ADR细胞增殖、周期、凋亡及阿霉素敏感性的影响：MTT法检测TCP1基因沉默对HL-60/ADR细胞增殖的影响；克隆形成实验检测细胞克隆形成能力的变化；流式细胞术检测TCP1基因敲减后HL-60/ADR细胞凋亡及周期的变化；MTT法及流式细胞术等检测敲减TCP1基因后HL-60/ADR细胞对阿霉素的敏感性影响。
4.Real time PCR及Western blot检测增殖、凋亡、周期相关蛋白（如c-Myc,Bcl-2，Bax，cleaved caspase3，CyclinE，CDK2，CDK6等）,PI3K/AKT/P27信号通路蛋白及耐药相关蛋白（如BCRP、GST-pi和MRP1等）的mRNA水平或蛋白水平变化。
研究结果：
1.HL-60/ADR细胞的半数抑制浓度（IC50）是HL-60细胞的200倍左右符合我们对耐药株的要求，与耐药性相一致的是HL-60细胞对阿霉素的吸收较HL-60/ADR细胞多且快；TCP1在HL-60/ADR细胞中的表达较HL-60细胞高，且在阿霉素处理下，TCP1在HL-60细胞及HL-60/ADR细胞中的表达与阿霉素的剂量和作用时间有相关性，TCP1可能与HL-60/ADR细胞耐药相关。
2.成功构建pLKO.1puro-TCP1-shRNA重组的慢病毒表达质粒载体并筛选出稳定沉默TCP1的HL-60/ADR细胞株，qRT-PCR及Western blot结果显示干扰组细胞TCP1mRNA和蛋白水平表达均明显下调,相较于对照组,干扰组TCP1mRNA含量下调82.18%。
3.敲减TCP1基因后HL-60/ADR细胞的生物学行为受到影响：MTT结果显示TCP1沉默后可以抑制细胞增殖；克隆形成实验发现,抑制TCP1表达HL-60/ADR细胞的克隆形成能力受到抑制，克隆形成抑制率为75.01%；流式细胞仪检测细胞周期结果表明,TCP1基因沉默后，G0/G1期细胞比例增多，S期和G2/M期细胞比例降低，细胞周期阻滞在G0/G1期；细胞凋亡检测结果显示，与对照组（NC组）相比，干扰组（KD组）细胞凋亡率显著升高；MTT法及流式细胞术检测细胞对阿霉素的敏感性，发现TCP1敲减后HL-60/ADR细胞对阿霉素的敏感性提高。
4.Real time PCR及Western blot检测了增殖、凋亡和周期相关蛋白，发现增殖、凋亡相关蛋白发生与表型相一致的变化，如c-Myc、p-Akt、抗凋亡蛋白Bcl-2下调，p27、促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase3、cleaved caspase9上调，周期相关蛋白CyclinE、CyclinD1、CDK2和CDK6下调；耐药相关蛋白BCRP、GST-pi、Topo2a和MRP1等的蛋白水平及mRNA水平均下调。
研究结论：
1.沉默TCP1基因后可抑制HL-60/ADR细胞增殖、延缓细胞周期进程及促进细胞凋亡。
2.干扰TCP1基因后可提高HL-60/ADR细胞对阿霉素的敏感性。
3.TCP1基因沉默后PI3K/AKT/P27信号通路受到抑制，推测PI3K/AKT/P27信号通路可能与TCP1基因对HL-60/ADR细胞生物学行为的调控相关。