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在酵母分泌表达系统中，启动子、分泌信号肽、终止子都是介导外源基因高效分泌表达的重要元件。为了研究信号肽在介导酵母中异源蛋白分泌表达的影响，本研究在天然菊粉酶基因信号肽CSS DNA序列的基础上，通过PCR突变技术，改造获得了一新的SI信号肽DNA序列，并将这两种信号肽与α-Factor信号肽分别构建了克鲁维酵母分泌表达载体、酿酒酵母分泌表达载体和毕赤酵母分泌表达载体。以菊粉酶基因为报告基因，将以上各相应分泌表达载体，分别导入鹰嘴豆孢克鲁维酵母宿主菌Y179U、乳酸克鲁维酵母宿主菌Y166、酿酒酵母宿主菌DCO4和毕赤酵母宿主菌GS115、SMD1168中，获得了菊粉酶分泌表达的酵母工程菌：Y179U/pUKD-S-P-CSS-Inu-T，Y179U/pUKD-S-P-SI-Inu-T，Y179U/pUKD-S-P-αF-Inu-T；Y166/pUKD-S-P-CSS-Inu-T，Y166/pUKD-S-P-SI-Inu-T，Y166/pUKD-S-P-αF-Inu-T；GS115/pPIC9K-CSS-Inu，GS115/pIC9K-SI-Inu，GS115/pPIC9K-αF-Inu；和SMD1168/pPIC9K-CSS-Inu，SMD1168/pIC9K-SI-Inu，SMD1168/pPIC9K-αF-Inu。检测以上各组工程菌的菊粉酶分泌表达水平表明：三种信号肽在上述几种酵母分泌表达系统中均能有效地指导菊粉酶基因的分泌表达。菊粉酶的酶活性检测结果也表明，以菊粉酶基因信号肽构建的表达工程菌：Y179U/pUKD-S-P-CSS-Inu-T，Y166/pUKD-S-P-CSS-Inu-T，GS115/pPIC9K-CSS-Inu，SMD1168/pPIC9K-CSS-Inu与Y179U/pUKD-S-P-SI-Inu-T，Y166/pUKD-S-P-SI-Inu-T，GS115/pIC9K-SI-Inu，SMD1168/pIC9K-SI-Inu比相应的α-Factor信号肽构建的表达系统的菊粉酶分泌表达水平明显更高。经过改造的菊粉酶基因信号肽比原信号肽也略显优势，它在鹰嘴豆孢克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母、酿酒酵母和毕氏酵母系统中都成功地指导了菊粉酶基因的分泌表达，说明经过改造的菊粉酶基因信号肽在各酵母系统中具有通用性，对非常规新型鹰嘴豆孢克鲁维酵母系统的开发和研制具有一定的应用意义，同时，获得的高水平分泌表达菊粉酶的鹰嘴豆孢克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母、毕氏酵母分泌表达菊粉酶工程菌也具有明显的开发和应用价值。 在上述研究的同时，我们获得了一株菊粉酶分泌表达工程菌突变株：GS115/pPIC9K-αF-Inu-M。该工程菌分泌表达产物的SDS-PAGE分析显示，表达产物蛋白的电泳迁移速率比通常的菊粉酶蛋白略快，分子量更小。该突变工程菌中编码菊粉酶基因的DNA序列分析以及该表达产物的菊粉酶酶活力分析均表明，该蛋白和正常菊粉酶蛋白没有区别。通过对表达产物的N-糖基化实验和蛋白结晶的结构分析，初步认为该表达蛋白分子量的变小可能是由于未受到N-糖基化的修饰引起的。因为通常糖基化修饰对蛋白的结晶进行结构分析会造成困难，而我们用该突变的表达蛋白能够顺利地得到蛋白结晶，N-糖基化实验也说明N-糖基化酶处理后的菊粉酶蛋白能够得到和突变表达产物蛋白相一致的酶切产物，关于信号肽在介导外源基因分泌表达的过程中存在不同的加工机制，有待进一步深入研究。