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背景:核酸是储存、复制和传递遗传信息的物质基础,是生物体正常的生长、发育、繁殖、以及遗传和变异等一系列重大生命活动的关键物质,同时参与生命体的各种病理活动。因此无论对核酸结构、功能进行研究,还是对基因工程、蛋白质工程等进行研究,对核酸进行分离纯化是首要解决的问题。核酸提取基本原理是利用各种方法,破裂细胞壁或细胞膜,使染色体及蛋白质发生变性反应,再用某些有机溶剂萃取核酸,然后经过沉淀、洗脱等过程,从而获取核酸。传统的核酸分离技术包含沉淀和离心等过程,该纯化方法的步骤繁杂、耗时长、提取率低,提取过程中会接触到有毒试剂,自动化程度低;而采用磁性载体微球分离技术则可较好的避免这些缺点,可实现核酸的高效、快速提取,是今后核酸纯化方法发展的一个重要方向。纳米磁珠纯化技术与20世纪70年代兴起,纳米磁性颗粒因其独特的性能,在生物医学领域得到了广泛应用,如细胞分离、核酸提取、药物载体与免疫识别等。纳米磁珠一般由磁性内核及高分子外壳构成,可在磁场中定向运动,且可与多种活性物质结合,如抗原、核酸、抗体等结合,因此纳米磁珠是提取核酸优良的载体。纳米磁珠法提纯核酸不需要离心和使用有机溶剂,操作安全简单。但目前磁珠提取核酸分子的试剂盒以及仪器费用较高,难以在临床核酸提取中得到普及应用。因此,研发一种种基于纳米磁珠为介质的新型核酸吸附-提取技术具有重要的临床意义。我们根据传统核酸提取技术的不足,自主研发了基于现有比较成熟的磁珠提取技术-纳米氧化铁磁珠表面包覆医用壳聚糖新型磁珠的提取技术,为人体全血核酸的提取提供了简易便捷的新方法。目的:研制一种新型壳聚糖纳米氧化铁磁珠,检测其理化性能,并观察其在提取人血DNA检测中的应用效果。方法:采用凝聚沉淀的方法,通过在纳米氧化铁磁珠表面包覆一层壳聚糖分子,制备出壳聚糖纳米氧化铁磁珠。对磁珠的粒径大小、显微特征、壳聚糖外壳和磁珠内核的关系以及壳聚糖磁珠的理化性能进行检测、分析;采购人体全血标本,分别用壳多糖表面纳米氧化铁磁珠及硅基磁珠提取人血标本DNA,并用凝胶成像分析系统观察及核酸微量测定仪分析。结果:1.电镜下观察壳聚糖表面包覆纳米氧化铁磁珠,磁珠分散性良好,无凝聚成团,覆盖约70%。2.在透射电子显微镜下可见,壳聚糖纳米氧化铁磁珠呈圆形颗粒状,形态、大小基本一致,磁珠分布均匀,粒径约在100~200nm之间。3.XRD检测结果显示其衍射峰位置与标准参数相一致,这些特征峰衍射角2θ出现在18.5°、30.2°、35.6°、37.2°、43.0°、53.4°、57.1°和62.5°分别对应于的晶面指数(111)、(220)、(311)、(222)、(400)、(422)、(511)和(440),而且没有其它杂质峰出现,说明样品中所含磁性核心为Fe3O4,单相立方晶型,产物纯度高。4.红外光谱图显示,壳聚糖纳米氧化铁磁珠的特征吸收峰出现在约3400cm-1、2370cm-1、1630cm-1和1080cm-1处,这与壳聚糖所带的基分子间氢键、甲基、酮羰基、醇羟基相对应,证明壳聚糖被包覆在磁珠表面,且通过氢键范德华力和静电作用等方式结合。5.过真空干燥后的粉末壳聚糖包覆纳米氧化铁磁珠的磁滞回线。结果显示磁珠的磁化强度在场强为-18000Oe时开始提高,-3000Oe~3000Oe区间提升最为明显,在20000Oe时基本达到饱和程度,该磁滞回线呈一条曲线、矫顽力趋近于零、几乎没有磁滞,具有良好的超顺磁性,饱和磁化强度为52.9emu/g。6.壳聚糖纳米氧化铁磁珠在交变磁场中,随着时间的延长,其温度逐渐上升,温度与时间呈线性相关。7.异丙醇替代液组的磁珠提取人血DNA电泳条带明显比原结合液组清晰,且异丙醇替代液组其260nm吸光度值(260nm Abs)及目标DNA浓度(conc)明显高于原结合液组,证明异丙醇在DNA提取过程中起到了优化作用。8.壳聚糖纳米氧化铁磁珠每条跑道上均可见DNA条带片段,硅基磁珠电泳条带更清晰、明亮;壳聚糖纳米氧化铁磁珠组其260nm Abs及conc值均明显低于硅基纳米氧化铁磁珠组(p<0.05),提示壳聚糖纳米氧化铁磁珠提取的全血DNA浓度较低,提取效果不如硅基纳米氧化铁磁珠。同时发现,壳聚糖纳米氧化铁磁珠组其OD260/280为1.8713±0.0825,提示不存在RNA、蛋白质、酚等污染,但OD260/230为0.4613±0.0770,明显低于2.0,提示提取的DNA样品中可能有盐和小分子杂质,如核苷酸、氨基酸、酚等污染。结论:成功制备了新型壳聚糖纳米氧化铁磁珠,其操作简便、易行,制备出的壳聚糖纳米氧化铁磁珠粒径均匀,成球性与稳定性好,且成功提取了人血DNA,为靶向药物载体、细胞分离、核酸提取等应用提供了实验材料,但仍比较硅基提取效果差,其提纯浓度和纯度并非十分理想,提取方法值得继续深入研究。