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成纤维细胞应用广泛，已成为许多研究工作的细胞模型，且将来有可能作为组织工程的种子细胞用于临床。皮肤成纤维细胞作为正常体细胞的一种，同样具有有限的生命，在经过有限次的细胞传代后，就会停止增殖，发生衰老和死亡，这就限制了成纤维细胞在科研与临床的进一步应用。具有无限增殖能力的永生化成纤维细胞的获得，将为有关科学研究及临床疾病的治疗创造一种全新的局面。 目前认为，细胞的寿命与端粒密切相关。端粒是真核生物细胞中位于染色体3’末端的一段富含G的DNA重复序列及其相关蛋白，其功能主要是维持染色体的稳定。由于存在末端复制问题，大多数细胞随着每次细胞分裂，丢失端粒序列约50—200个核苷酸，当端粒缩短至一定长度时，即引起细胞衰老，死亡。端粒长度的维持主要依赖端粒酶的作用。端粒酶是一种由RNA和相关蛋白质组成的核糖核蛋白体复合物，能以自身RNA为模板合成端粒DNA，维持端粒长度。正常体细胞中几乎不表达端粒酶活性，仅在生殖细胞、造血干细胞、表皮生发层细胞等具有再生能力的细胞中存在不同水平的端粒酶活性表达，而在肿瘤细胞和永生化细胞常存在着端粒酶的高表达。恢复细胞端粒酶活性，可使细胞寿命延长，甚至发生浙江大学研究生论文永生化。我们将人端粒酶催化亚单位导入表达hTR的正常人成纤维细胞，建立了一株人源性成纤维细胞系。在确认外源性hTERT基因导入、表达和端粒酶活性恢复的同时，证实细胞体外培养寿命无限制延长，且保持正常细胞特性，同时我们对它们进一步用于临床的安全性进行初步研究。研究目的:建立一株人源性成纤维细胞系。通过逆转录病毒介导将人端粒酶催化亚单位(hTERT)导入正常人成纤维细胞，以恢复细胞端粒酶活性，进而延长其寿命，并分析其生物学特性。研究方法:.PLPCX逆转录病毒载体的构建及鉴定:将人端粒酶催化亚单位全长cDNA片段正向插入到pLPCX多克隆位点的EcoRI酶切位点上，酶切、测序等方法确定hTERr正向插入。2.人成纤维细胞的原代分离和培养:采用组织块贴壁法原代分离人成纤维细胞，培养液为含15%小牛血清的DMEM培养液，置3丫C、5%c 02培养箱培养。3.逆转录病毒的制备及滴度测定:采用磷酸钙转染技术将构建的pLPCX一hTERT逆转录病毒载体导入包装细胞系PT一67中，终浓度为2协g/ml的嗦吟霉素筛选培养基进行筛选，筛选获得的阳性细胞克隆扩增培养，收集病毒上清，经0.22pm滤膜过滤后，以N工H3T3细胞测定病毒滴度并冻存于一7了C备用。4.重组逆转录病毒感染人成纤维细胞:感染前一天将成纤维细胞(2 X 10亨孔)接浙江大学研究生论文种于六孔板中，培养至60%一7既细胞密度时，吸弃培养上清，加入含病毒的培养液Zml及Polybrene(8协g/ml)，37‘’C、5%C 02培养24小时。换新鲜培养基继续培养48小时后，按l:10传代，24小时贴壁后以终浓度为0.5 pg/ml的嗦吟霉素筛选培养基筛选，筛选获得的细胞克隆进行扩增培养。5.转染细胞外源性hTERT基因的PCR分析:收集正常成纤维细胞和感染后的成纤维细胞，提取基因组DNA，以其为模板，扩增外源性hTERT基因片段。运用在正常细胞基因组中hTERI，基因被内含子分隔的原理，设计二对位于内含子两侧的引物对感染细胞基因组中外源性hTERT基因进行PCR分析，质粒DNA作为阳性对照。PCR产物在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳分析。6.TRAP一PCR法检测转染成纤维细胞端粒酶活性:用TRAP一PCR法对感染后传代50代的成纤维细胞进行端粒酶活性检测。按TRAP检测试剂盒(Oncor)说明进行活性测定。正常成纤维细胞为阴性对照。7.转染细胞hTERT蛋白的表达:收集感染后传代50代的成纤维细胞，制备蛋白样品，Western一blot法检测细胞hTERT的表达，正常成纤维细胞为阴性对照。8.染色体核型分析:取对数生长期的转染后传代第50代细胞，加入0.04 pg/ml秋水仙素，37‘℃、5%CO:继续培养3小时，胰酶消化细胞，离心后37’.C预温的低渗液(0.钱氯化钾:0.4%柠稼酸钠二1:1)低渗处理30分钟，离心之后用2:1的甲醉:冰乙酸重悬细胞，离心后固定30分钟，重复三遍，最后制成单细胞悬液滴加在预冷的载玻片上，Giemsa(Giemsa千液:蒸馏水二1:9)染色五分钟，油镜下观察并进行染色体核型分析。浙江大学研究生论文9.感染后成纤维细胞生长曲线的绘制:取对数生长期的感染后50代成纤维细胞制备成单细胞悬液，置96孔板中，每孔1.5X10，个细胞。试验分五组，每组设5复孔，分别于1、2、3、4和5天后进行细胞计数，取平均值。以培养时间为横坐标，细胞570nm吸光度值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。研究结果:成功地建立了一株人源性成纤维细胞系。稳定生长的成纤维细胞能稳定表达端粒酶活性，细胞培养寿命延长，形态无明显改变，维持正常正常生物学特性和细胞表型。在对人成纤维细胞系细胞基因组中外源性hTERT基因的PCR分析中，我们可以观察到人成纤维细胞系细胞和阳性对照质粒均有特异性的464和1 51bp扩增片段，阴性对照正常成纤维细胞无扩增片段，说明外源性hTERT基因己整合到人成纤维细胞系细?