论文部分内容阅读
研究背景与目的：恶性肿瘤越来越成为人类的杀手，给世界尤其是发展中国家带来沉重负担。据WHO公布，目前约有2千5百万肿瘤患者，每年新增病例达1千万左右，到2020年将达到3千万患者，新增病例达每年1千6百万，且每年将有1千万人死于肿瘤疾病。鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是来源于人类鼻咽上皮细胞的恶性肿瘤，其病因涉及遗传因素、EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)感染和化学致癌物作用，是一种经典的复杂性状疾病。鼻咽癌在世界范围少见，但在中国南方、东南亚和北非的部分国家非常常见。
目前对导致鼻咽癌的基因研究仍未有突破性进展，一般认为鼻咽癌是遗传因素，EB病毒和环境因素及其相互作用的结果。因此鼻咽癌是研究“基因一环境一病毒”相互作用导致癌症病理发生的一个极具代表性的模型。1975年，SimonsMJ报道了人类白细胞抗原(Human Leukocyte Antigen，HLA)基因座和鼻咽癌的发病风险相关，许多后来的研究也肯定了这一发现[1]。Lu SJ等开展了受累同胞对连锁分析，他们的研究结果表明HLA区域可能存在与鼻咽癌相关的易感基因。在易感基因定位方面除了发现HLA位点或者其单体型与鼻咽癌有关外，湖南一个研究小组运用鼻咽癌家系标本将易感位点定位在染色体3p21上。同时，在对候选基因的关联研究中，相关联的多态位点还有T细胞受体TCR(T cellreceptor)基因，谷胱甘肽转移酶GSTM I(Glutathione S-Transferase M1)基因，细胞色素氧化酶P4502E1基因，多聚免疫球蛋白受体PIGR(Polyimmunoglobulinreceptor)基因。热休克蛋白HSP70-2和DNA修复酶基因XRCC1(X-ray repaircross-complementing group1)，hOGG1(human8-Oxoguanine DNA Glycosylase)以及其他的一些基因也被报道和鼻咽癌的发病风险相关。这些研究结果提示可能很多基因参与了鼻咽癌发生不同的信号转导通路或细胞功能的活化，它们的协同作用导致了鼻咽癌的发生发展，而这与肿瘤的多因素遗传模式是吻合的。
对于鼻咽癌的家族聚集性已经有许多文章报道，在以前的研究中我们发现，在2,252个先证者组成的家系中，与其他方言相比，在操广东话的家系中鼻咽癌呈现更明显的家族聚集现象。针对32个广东鼻咽癌家系运用全基因组连锁分析，我们把鼻咽癌的易感区域定位在染色体4p15.1-q12。后来，加进更多的微卫星标记和单核苷酸多态性标记，并对该区域的基因进行筛选，目标集中在外显子，启动子和外显子-内含子的交界处。我们发现一新基因LOC344967的上游调节区携带的一个SNP位点-32G/A，在我们研究的31、34、62和43号核心家系中和疾病表型共分离。我们基于前期大量遗传学分析认为LOC344967基因可能与鼻咽癌发病高度相关。
尽管其生物学功能仍未明确，RT-PCR结果显示在包括鼻咽癌在内的多种癌组织和鼻咽癌细胞系中都检测到它转录水平的表达。LOC344967基因广泛的组织分布说明它可能具有重要的生物学功能。生物信息学分析显示LOC344967可能属于硫酯酶超家族，与人BACH蛋白高度同源。
硫酯酶在从低等到高等生物中具有高度的进化保守性，在不同组织都具有广泛的活性。真核生物中包括溶酶体，过氧化物酶体，线粒体及胞质中都能检测到硫酯酶活性。至今为止，许多硫酯酶的功能并不非常明确，一般认为它对脂肪代谢起到调控作用，参与细胞内物质的转运，参与细胞内吞作用。硫酯酶还调节了某些蛋白的酰化状态，包括信号传导蛋白及细胞内定位。硫酯酶II还可作为兔乳腺癌发生和人类肿瘤中乳腺来源的标记[13，14]。Liu，L.X报道硫酯酶可调节HIV病毒的Nef诱导CD4阳性T细胞下调[15]。某些硫酯酶的表达异常有可能导致细胞及组织的异常筋挛和增殖，从而引发各种相关疾病，如炎症，免疫系统疾病及肿瘤的发生。
脂肪酸代谢是动植物中广泛存在的生理过程。脂肪酸参与细胞内能量的储存、胞膜的组成、信号转导的级联反应、蛋白质酰基化作用、细胞极化和迁移等重要过程。大量临床、基础研究表明肿瘤具有独立的合成脂肪酸进行能量补充、胞膜磷脂合成的能力，而且这种合成似乎并不依赖存在于正常细胞中的可调节脂肪酸合成的调节信号。肿瘤的内源性脂肪酸合成为肿瘤细胞的生长提供了极其重要的脂肪酸来源。
因而，我们在LOC344967与硫酯酶活性、脂肪酸代谢和肿瘤发生发展的关系上做更深入的研究。
方法：通过RT-PCR方法从鼻咽上皮细胞系NP69中扩增LOC344967及hBACHa的cDNA序列，插入各种单独表达或融合表达的表达载体。体外瞬时表达后，检测细胞的硫酯酶活性及各项与细胞增殖相关参数；检测LOC344967瞬时表达后脂肪酸组成改变，活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)产生水平及细胞ATP水平的变化。
构建LOC344967转基因小鼠，观察该转基因小鼠的表型及各器官表达情况，及各器官的脂肪酸组成。通过小鼠尾静脉注射B16小鼠黑色素肿瘤细胞，观察B16细胞在转基因小鼠肺中的实验性转移情况及其与野生型小鼠的区别。
结果：通过全细胞酶活检测，我们证实LOC344967虽然与硫酯酶hBACHa高度同源，但由于在N端存在缺失，导致硫酯酶活性的丧失。有意思的是，LOC344967可以通过诱导hBACH的降解，抑制内源性硫酯酶活性的作用，从而上调Acyl-CoA水平，进而导致细胞ATP水平上升，活性氧ROS浓度升高。
相反，通过hBACHa的过表达则导致ATP水平下调及活性氧ROS浓度降低。相应的MTT实验及流式结果证明了F/LOC能促进细胞增殖，而hBACHa则抑制细胞增殖。
同时，我们还发现F/LOC在细胞中高表达能导致细胞总脂肪酸中c9，t11和t10，c12两种共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid，CLA)亚型含量显著上升。这种功能性脂肪酸可以通过上调活性氧的水平，促使细胞自噬的发生，这也可能是促进细胞ATP水平上升的机制之一。
在转基因小鼠中，F/LOC主要表达于肾和肺中，并导致这些组织中c9，t11和t10，c12两种亚型的共轭亚油酸(CLAs)含量显著升高：在尾静脉注射B16肿瘤细胞的实验性肺转移实验中，在F/LOC转基因杂合子小鼠的肺中形成的转移灶明显比野生型小鼠少，提示了CLAs的升高可以抑制肿瘤转移的发生。
结论：我们首次证明了LOC344967编码的蛋白具有抑制细胞内硫酯酶活性的功能，并能改变脂肪酸的组成，明显升高共轭亚油酸的含量。从而导致了活性氧ROS产生增加，ATP水平上升，最终促进了细胞增殖。
而在LOC344967的转基因小鼠体内实验中证明脂肪酸的改变，共轭亚油酸的升高可以抑制肿瘤的转移。