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肌腱损伤是外伤后较为常见的一种疾病,因为肌腱组织的特殊性,其修复过程往往因为粘连而伴有功能的障碍。如何能在促进修复的同时减少与腱周组织的粘连成为亟待解决的问题。目前对肌腱的研究已证明,在肌腱的修复过程中包括外源性修复和内源性修复两种机制。所谓内源性修复是指通过组织液营养下肌腱细胞自身修复损伤所达到的愈合,这种愈合可以避免肌腱粘连的形成。而外源性愈合是指通过肌腱外周组织的滑膜及结缔组织在肌腱断端产生肉芽组织,同时肌腱外膜中的成纤维细胞增殖并随毛细血管长入肌腱断面,最终通过肉芽组织修复损伤,这种愈合速度较快,但粘连较重。在肌腱修复的过程中,两种机制同时作用,通常情况下外源性愈合占主导地位,因此肌腱的愈合过程不可避免产生粘连,影响正常功能。由此可见,在肌腱损伤的修复中,如何促进内源性愈合,抑制外源性愈合是预防肌腱粘连、重建肌腱功能的关键。
血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)是一种可作用于包括肌腱细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞等多种细胞并促进其生长的一种生物活性物质。现已证明,合适浓度的PDGF-BB对肌腱细胞生长有促进作用,可以通过增加局部PDGF-BB的量来促进肌腱细胞生长,达到损伤的内源性愈合效果。但是,生长因子作为一种生物活性物质,进入体内会迅速在体内弥散、分解、失活,从而不能达到理想的效果。如何能在损伤部位持续稳定的给予一定剂量的PDGF-BB就成为亟待解决的问题。本研究通过将PDGF-BB转染大鼠肌腱细胞中,并获得稳定表达的细胞,将其植入大鼠肌腱损伤模型中,研究其在促进肌腱愈合、防止肌腱粘连方面的作用机制,并于局部给予PDGF-BB的作用效果相比较,探讨更好地利用生长因子的方法。
方法:
1.PDGF-BB基因转染大鼠肌腱细胞;
2.120只大鼠随机分为A、B、C、D四组,建立跟腱损伤模型;
3.A组:实验组,肌腱断端注射PDGF-BB基因转染的肌腱细胞;B组:对照组,肌腱断端注射肌腱细胞;C组:PDGF-BB注射组,肌腱断端注射PDGF-BB;D组:空白对照组;
4.6-0丝线行改良Kessler法缝合跟腱,管型石膏固定一周;
5.分别于术后第3d、1w、2w、4w、8w取样;
6.各组行大体观察,并于第4w,8w两时间点行肌腱粘连度评分;
7.分别于第3d、1w、2w、4w、8w取肌腱断端标本行组织学观察,包括HE染色,并在第4w,8w两时间点行Masson染色,比较各组胶原纤维含量;
8.分别在第4w,8w两时间点取标本行生物力学检测,检测肌腱最大抗拉力及最大活动距离;
9.肌腱断端组织提取总蛋白行Elisa检测,绘制标准曲线,定量计算组织中PDGF-BB的浓度。
结果:
1 PDGF-BB基因转染肌腱细胞经过RT-PCR以及基因测序证实在体外稳定表达。
2 A、B、D三组比较
2.1 A组成纤维细胞数量在第3d、1w、2w、4w、8w分别为(153±18)个、(145±20)个、(130±20)个、(117±17)个、(99±14)个,与B组相比除3d和1w时间点外均显著下降(t值分别为2.94、4.26、5.76,P<0.05或P<0.01);
2.2 A组胶原纤维含量在第4w时间点为(43±6)%,与B组相比显著下降(t值为2.94,P<0.05);
2.3 A组生物力学检测结果第4w和8w时间点肌腱最大滑动距离和最大抗拉力分别为(3.25±0.33)mm、(3.65±0.21)mm和(79.03±11.40)N、(81.18±13.73)N,其中肌腱最大滑动距离优于B组(t值分别为4.53和8.29,P<0.01),但在肌腱最大抗拉力方面与B组无统计学差异(t值为0.41,P>0.05);
2.4 Elisa方法检测A组肌腱组织中PDGF-BB含量在第3d、1w、2w、4w时均显著高于B组,至第8w时为(2.63±0.31)ng=/ml,与B组相比无统计学意义(t值为0.54,P>0.05)。
3.A、C、D三组比较,即内源性与外源性PDGF-BB对损伤肌腱的作用效果比较
3.1 C组成纤维细胞数量在第3d、1w、2w、4w、8w分别为(156±21)个、(150±19)个、(144±18)个、(126±19)个、(119±18),与A组相比在各个时间点均无显著差异(t值分别为0.27、0.44、1.27、0.86、2.15,P>0.05);
3.2 C组胶原纤维含量在第4w、8w分别为(46±6)%,(42±7)%。与A组相比并无显著性差异(t值分别为0.87、1.14,P>0.05);
3.3 C组生物力学检测结果第4w和8w时间点肌腱最大滑动距离和最大抗拉力分别为(3.05±0.31)mm、(3.09±0.41)mm和(79.29±18.03)N、(82.35±15.12)N,其中肌腱最大滑动距离在第8w时低于A组(t=2.98,P<0.05),但在肌腱最大抗拉力方面与A组无统计学差异(t值分别为0.03和0.14,P>0.05);
3.4 Elisa方法检测C组肌腱组织中PDGF-BB含量在第3d、1w、2w、4w及8w时分别为(32.31±4.80)ng/ml、(12.71±1.15)ng/ml、(4.72±0.63)ng/ml、(2.47±0.34)ng/ml及(1.58±0.24)ng/ml。第3d显著高于A组(t=9.50,P<0.01),第1w与A组相比并无统计学意义(t=2.17,P>0.05),第2w、4w和8w时均显著低于A组(t值分别为7.79、14.59、6.56,P<0.01)。
结论:
1.运用PDGF-BB基因转染肌腱细胞注射有促进肌腱内源性愈合、减轻肌腱粘连的作用;
2.外源性应用PDGF-BB也存在促进肌腱愈合、预防粘连等作用;
3.内源性PDGF-BB与外源性应用PDGF-BB比较,肌腱最大滑动距离在第8w时,内源性PDGF-BB组较外源性组有较明显改善,但成纤维细胞数,胶原纤维含量及最大抗拉力等方面并无统计学差异。从研究结果看,内源性PDGF-BB在促进肌腱愈合及预防肌腱粘连等方面仍然有优于外源性PDGF-BB的趋势。