论文部分内容阅读
酰胺类除草剂乙草胺是我国使用最多的三大除草剂之一,它通过抑制杂草体内蛋白质合成而起到除草作用。由于其具有中等到较高的水溶性,相对较低的土壤吸附性,因而施用到农田后容易通过渗透转移到浅层地下水或者随雨水径流进入地表水,在环境中多次被检出。EPA已将乙草胺列为B-2类致癌物。因此,乙草胺的毒理学研究对生态风险评估具有有者重要的意义。本文以模式生物斑马鱼为受试对象,从甲状腺轴、性腺轴及抗氧化酶系等角度,研究乙草胺对斑马鱼内分泌系统的干扰效应,并探讨其潜在的作用机制。本文采用QuEChERS和HLB固相萃取技术建立乙草胺和16种类固醇激素UHPLC-MS/MS检测方法。通过实验优化了仪器条件和样品前处理方法,如SPE柱,淋洗剂、pH等。17种化合物在鱼肉组织和水中的平均回收率分别为73.0～118.8%和70.3～117.1%,LOD分别为0.03～9.04 ng/g和0.01～0.98 ng/mL。该方法取得了良好的准确度及精密度,为本文进一步探索乙草胺对斑马鱼类固醇激素的干扰作用提供了技术支持。乙草胺对斑马鱼成鱼急性毒性、胚胎急性毒性和致畸效应以及生物富集实验表明：乙草胺对斑马鱼成鱼96-hLC50为2.90mg/L,属于中等毒性,在性腺中有检出,但无富集；胚胎120-h LCso为5.09 mg/L,较成鱼不敏感。乙草胺对斑马鱼胚胎6-120dph的曝露使胚胎存活率、孵化率降低,畸形率增加,引起包括身体弯曲和心包水肿等致畸现象。研究了窗口期曝露乙草胺对斑马鱼的甲状腺系统内分泌干扰效应。乙草胺(0、1、3、10、30、100和300μg/L)对斑马鱼仔鱼7-21 dpf窗口曝露,高浓度组(30、100和300μg/L)致使T3水平显著下降,T4水平显著上升,体重增加。下丘脑—脑垂体—甲状腺轴(HPT轴)中tsh,tra,tpo,slc5a上调和dio1,ugt1ab,ttr下调,基因变化与阳性对照T3曝露相似,表明乙草胺浓度的升高对斑马鱼甲状腺系统产生了显著的类似于T3的生长促进效应,其可能的作用机制：乙草胺与T3竞争性结合使受体TRa上调干扰体内T4/T3激素平衡,导致斑马鱼生长过速,进而对下丘脑和垂体反馈调节增加,同时过度分泌促甲状腺激素TSH加速了T4/T3的合成,并对甲状腺器官功能可能产生不利的影响。研究了短期曝露乙草胺对斑马鱼性腺系统的影响。乙草胺(0、0.03和0.3 mg/L)染毒14天后,雌鱼的性腺、肝腺指数与对照组不存在显著差异；卵巢中有乙草胺检出,且随之曝露时间的延长其含量有增加的趋势。类固醇激素T、E2、ASD的含量与空白对照相比均显著下降,而17-OHP含量显著升高。在基因转录水平上,乙草胺曝露使era、cyp17a1、vtg Ⅰ和vtgⅡ显著上调,ar、apgr、cypl9a、cypl9b、17bhsdl和17bhsd3显著下调。这些激素和基因变化与阳性对照E2曝露的结果相似。研究表明,乙草胺可能通过抑制17p-羟类固醇脱氢酶和芳香化酶CYP19活性,使雄烯二酮(ASD)转化为睾酮(T)和雌二醇(E2)的过程受到抑制,降低了体内尤其是性腺中性激素T和E2的水平,同时通过竞争性抑制雄激素受体与T结合的方式,表现出抗雄激素效应或类雌激素效应。研究了短期曝露乙草胺对斑马鱼抗氧化酶系和能量代谢酶的影响。结果显示乙草胺(0、0.03和0.3 mg/L)14天曝露使斑马鱼雌鱼肝脏中的SOD、CAT、POD、GST活性和GSH含量随胁迫程度增加,表现为先上升后下降的趋势：MDA含量随胁迫程度增加而上升；ATP酶、Na+K+-ATP酶和Ca2+Mg2+-ATP酶活力随胁迫程度增加均表现为抑制。表明外源污染物乙草胺对斑马鱼的氧化酶系和代谢酶具有氧化胁迫作用,其可能的作用形式：在肝脏中因代谢乙草胺产生了大量的自由基,低浓度时促使氧化酶系包括SOD、CAT、POD和GST活性受到诱导,逐渐达到最高水平；同时,大量消耗能量(ATP)、进而抑制ATP酶、Na+K+-ATP酶和Ca2+Mg2+-ATP酶的活力。随曝露时间和药剂处理浓度的增加,大量的自由基无法被处在已饱和状态的氧化酶系所催化,使得自由基开始攻击如氨基酸、酶等,致使酶活性降低。另一方面,大量的自由基产生,脂质过氧化作用的增强,使MDA不断累积,导致斑马鱼细胞膜脂质体、蛋白质和DNA的发生氧化损伤和内分泌平衡进一步紊乱。通过本论文的研究,从下丘脑—垂体—甲状腺轴(HPT)、下丘脑—垂体—性腺轴(HPG)、抗氧化酶系等多角度较为系统的评价了乙草胺对斑马鱼的内分泌干扰效应并初步探讨了其干扰作用的机制。研究结果表明环境中的乙草胺可能通过干扰甲状腺素平衡、类固醇激素的关键酶以及受体同时对鱼体的发育与生殖产生内分泌干扰作用。在水生生态系统中具有潜在的危害,对人类健康具有潜在的影响,故对该农药的使用需要严格管理。