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砷污染问题在全球范围内普遍存在,中国也是砷污染最为严重的国家之一。人类工业废水的直接排放等活动造成砷和其他重金属元素在近海海域和土壤中积累现象也较为普遍。砷污染问题已经严重威胁着沿海等地区农业生产、生态环境和人畜健康。砷流入人体最主要的途径之一是通过食物链的传递。因此,阐明植物对砷的吸收转运及代谢调控途径的生物学机理对控制砷在食物链的传递意义重大。目前,As(Ⅲ)通道活性调节机制还缺乏详细文献报告。我们的前期研究发现NIP1;1的活性调节跟植物砷的耐受性密切相关。本研究以哥伦比亚背景的野生型拟南芥、耐砷突变体nip1;1和蛋白激酶缺失突变体cpk31为研究材料,酵母双杂交实验和双分子荧光互补技术证明了钙调蛋白激酶成员CDPK31与NIP1;1之间的互作。突变体cpk31和突变体nip1;1一样也具有As(Ⅲ)耐受表型,而且突变体cpk31与nip1;1的地上部分和地下部分都比野生型拟南芥积累的砷更少。此外,我们发现CDPK31的组织表达模式也与NIP1;1一致,尤其是在根部维管束的表达几乎完全一样。As(Ⅲ)胁迫下CDPK31和NIP1;1的表达都下调,因此,CDPK31和NIP1;1很可能是在同一个代谢通路中。在砷胁迫下,植物很可能通过下调CDPK31的表达来降低对NIP1;1的激活,从而减少植物对砷的吸收和砷由地下部分向地上部分的运输。本研究主要探讨Ca2+和CDPK31在砷吸收代谢中的调控作用。主要结果如下:1.我们通过酵母双杂交的筛库实验和酵母双杂交点对点实验,证明NIP1;1与CDPK31的互作,双分子荧光互补实验结合亚细胞定位技术的结果也进一步证明了NIP1;1与CDPK31在拟南芥原生质体的质膜发生互作。2.As(Ⅲ)处理耐砷突变体nip1;1-1,nip1;1-2和蛋白激酶CDPK31缺失突变体cpk31-1、cpk31-2 和 cpk31-3 的表型分析实验发现,cpk31-1、cpk31-2 和 cpk31-3 与野生型相比均具有耐砷表型,但比nip1;1-1和nip1;1-2对砷的耐受性弱,而且双突变体cpk31-1nip1;17和nip1;1一样对As(Ⅲ)耐受性较强。这暗示着蛋白激酶CDPK31可能正调控NIP1;1的活性。检测10 μmol· L-1As(Ⅲ)处理不同时间后的野生型拟南芥(Col-0)、nip1;1-1和cpk31-1突变体中的砷含量发现,cpk31-1和nip1;1-1突变体一样在地下部分和地上部分积累的砷更少。同样的表型和砷积累模式表明CDPK31很可能是NIP1;1的正调控因子。3.GUS染色结果显示:CDPK31的表达模式与NIP1;1一致,二者都在根部的维管束中的中柱细胞表达较多,CDPK31在叶肉细胞以及气孔的保卫细胞上都有表达,在生殖器官花的萼片、柱头也有表达,果荚的顶端基部也有表达。在NIP1;1表达的部位CDPK31都有表达,在花中的表达说明CDPK31可能影响砷在种子中的积累和地下部分到地上部分的长距离运输。4.实时定量 PCR 分析发现,10 μmol·L-1 As(Ⅲ)处理Col-0后,NIP1;1 和 CDPK31在根部的表达量都降低,NIP1;1在叶片中的表达量上升,而NIP1;1和CDPK31在三周大的植株中主要表达在根部,这意味着拟南芥不仅可以通过降低NIP1;1的表达量来减少As(Ⅲ)的胁迫,同时也可以通过降低CDPK31的表达来减少CDPK31对NIP1;1的激活。拟南芥可能优先通过降低CDPK31的表达这条途径来抵抗As(Ⅲ)的胁迫。5.亚细胞定位技术分析NIP1;1表达变化:砷和钙单独或同时处理拟南芥时,Ca2+和As(Ⅲ)同时处理时野生型和突变体植株都比只用As(Ⅲ)处理时长势好,As(Ⅲ)处理mCherry-nip1;1(RFP标记NIP1;1基因)拟南芥幼苗后,在激光共聚焦显微镜下观察时发现NIP1;1在拟南芥根部细胞中的表部位和表达量都发生变化,表达部位由细胞质转移到质膜和液泡膜,而且随着钙浓度的增加,NIP1;1在质膜的表达先增加后降低。这表明钙离子可能通过某种途径减少NIP1;1的表达而减少拟南芥对砷的吸收,从而增强拟南芥对砷的耐受性。综合以上结果和分析,根据q-PCR定量分析CDPK31和NIP1;1的表达模式和突变体的砷积累模式结果,我们得出CDPK31的生理功能是通过与NIP1;1互作而正调控NIP1;1的活性,拟南芥通过下调CDPK31的表达或降低CDPK31的活性来正调控下游信号通路中NIP1;1的表达,从而增强拟南芥对As(Ⅲ)的耐受性。