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背景：肌球蛋白轻链激酶(myosin light-chain kinase， MLCK)是决定淋巴管与血管收缩和舒张的关键酶。研究表明，失血性休克(hemorrhagic shock， HS)发展进程中存在淋巴微循环障碍，淋巴管收缩功能与休克的发展密切相关，休克不同时相的淋巴管收缩性表现为双相变化，即休克早期淋巴管收缩性增强、重症休克期淋巴管收缩性降低，MLCK是否参与休克淋巴管收缩性的双相调节，未见报道。同时发现，休克肠淋巴液回流是导致血管低反应性的重要因素，结扎肠系膜淋巴管或肠淋巴液引流均可提高休克大鼠的血管反应性与钙敏感性，MLCK是否参与休克肠淋巴液介导血管低反应性的分子机制，值得研究。
目的：本研究复制HS模型，针对休克淋巴管收缩性的双相变化，采用离体淋巴管灌流技术，应用MLCK工具药，观察MLCK对离体淋巴管泵活性的影响，探讨MLCK在休克离体淋巴管收缩性双相变化中的作用机制，为休克淋巴管收缩性的调控提供实验依据；针对休克肠淋巴液对降低血管反应性的作用，采用离体血管张力测定技术，应用MLCK工具药，观察MLCK对休克大鼠血管反应性与钙敏感性的影响，探讨MLCK在休克肠淋巴液介导血管低反应性与钙失敏的作用机制，以肠淋巴途径为切入点，为休克血管低反应性的临床干预提供实验依据与理论参考。
方法与结果：
第一部分、 MLCK在失血性休克大鼠离体淋巴管收缩性双相变化中的作用及其机制
方法：Wistar雄性大鼠随机均分为对照组、Shock组（复制HS模型，分为休克0h、0.5h、1h、2h、3h亚组），所有大鼠经戊巴比妥钠肌肉注射麻醉后，行股部手术，右股静脉注射肝素钠全身抗凝，右股动脉插管连接生物信号采集系统，连续监测平均动脉血压(mean artery pressure，MAP);左侧股动脉插管后连接注射器固定于抽注机上备放血用。待所有手术完成、稳定30min后，休克组大鼠经左股动脉匀速放血，10min内将MAP降至40mmHg，复制失血性休克模型。对照组大鼠进行相同的手术操作，但不放血。在对照组完成手术后30min、休克各组在相应时间点，留取胸导管组织，用于Western blot法检测MLCK蛋白表达；利用离体淋巴管分离技术，在对照组完成手术稳定30min后、休克大鼠各时间点，分离胸导管，手术显微镜下分离干净胸导管周围组织，制备离体淋巴管，移入微血管压力-直径测定仪的浴槽内、固定、孵育，待淋巴管出现稳定的自发性收缩后，观察淋巴管在不同跨壁压(1cmH2O、3cmH2O、5cmH2O)下的收缩频率（contraction frequency， CF）、收缩末期口径(end systolic diameters， ESD)、舒张末期口径(end diastolic diameters， EDD)、被动管径(passive(relaxed) diameters， PD)的变化，根据检测的淋巴管各口径和频率，以紧张指数(tonic index， TI)、收缩幅度(contraction amplitude， CA)、泵流分数（fractional pump flow， FPF）等指标，结合CF作为评价淋巴管活性的指标。其中：TI=(PD-EDD)/PD×100％;CA=(EDD-ESD)/PD×100％;FPF=(EDD2-ESD2)/EDD2×CF。同时另取shock0.5h与2h组大鼠的淋巴管条，分别与MLCK抑制剂ML-7、激动剂P物质( SP)单独或共同孵育(具体分组为：shock0.5h+ML-7、shock0.5h+ML-7+SP、shock2h+SP、shock2h+SP+ML-7)，观察MLCK在休克淋巴管收缩性双相变化中的作用。
结果：Shock0h和0.5h淋巴管组织MLCK蛋白显著高于对照组；随着休克发展，MLCK蛋白表达逐渐降低。在1、3、5cmH2O等多个跨壁压下，shock0.5h组淋巴管的CF、TI、FPF均显著高于对照组，ML-7可显著下调这些指标，SP则可明显降低ML-7的作用，使之恢复至shock0.5h水平；shock2h组淋巴管的CF、TI、FPF均显著低于对照组，SP可显著上调这些指标，ML-7则可显著降低SP的作用。shock0.5h与2h离体淋巴管CA与对照组相比无显著变化，SP可降低shock2h淋巴管的CA、ML-7可抑制该作用，但二者对shock0.5h无明显作用。结果表明，MLCK作为影响淋巴管平滑肌细胞收缩的关键酶，参与了HS发展进程中淋巴管收缩性的双相调节。
第二部分 MLCK在休克肠淋巴液介导大鼠血管低反应性中的作用及其机制
方法：24只Wistar雄性大鼠随机均分为假手术组(Sham)、休克组(Shock)、休克肠淋巴液引流1组(shock mesenteric lymph drainage from shock0h， shock+drainage0-3h)、休克肠淋巴液引流2组(shock mesenteric lymph drainage from shock1h， shock+drainage1-3h)，所有动物均行股部手术用于复制HS模型、腹部手术用于肠系膜淋巴管剥离，其中shock+drainage0-3h与shock+drainage1-3h组大鼠行肠系膜淋巴管插管，分别于休克0h、1h引流休克肠淋巴液至休克3h。待所有手术完成、稳定30min后，休克组与引流组大鼠按前述方法复制动物模型；假手术组进行相同的手术操作，但不放血。休克组、两个引流组在维持低血压3h后、假手术组在相应时间点，留取肠系膜上动脉(superior mesenteric artery， SMA)，每根SMA制备2条血管环，一条用于血管反应性观察，另一条用于钙敏感性测定。另取12只大鼠，作为shock组与shock+drainage1-3h组(n=6)，每只动物制备2根血管环，shock组血管环和休克组大鼠的血管环分别与MLCK激动剂SP孵育、shock+drainage1-3h组大鼠的血管环与MLCK抑制剂ML-7孵育后，进行血管反应性与钙敏感性测定，评价MLCK在休克肠淋巴液介导大鼠血管低反应性中的作用。
结果：Shock3h组大鼠的血管环对各浓度NE、shock+drainage0-3h组大鼠的血管环对NE(自10-8mol/L起)的收缩反应性均显著低于sham组，shock+drainage1-3h组大鼠的血管环对各浓度NE的收缩反应性与sham组均无统计学意义；shock+drainage0-3h组自NE浓度10-6mol/L起、shock+drainage1-3h组自10-8mol/L起均显著高于shock3h组；且shock+drainage1-3h组自10-7mol/L起均显著高于shock+drainage0-3h组。Shock3h组大鼠血管环对梯度钙离子（自10-4mol/L起）、shock+drainage0-3h组在10-2mol/L、3×10-3mol/L时的收缩性均显著低于sham组，shock+drainage1-3h组大鼠的血管环对各浓度钙离子的收缩反应性与sham组均无统计学意义；shock+drainage0-3h、shock+drainage1-3h组自10-4mol/L起均显著高于shock3h组；且shock+drainage1-3h组自10-3mol/L起均显著高于shock+drainage0-3h组。同时，shock3h对梯度NE与钙离子Emax、pD2、shock+drainage0-3h组对梯度NE的Emax、pD2以及梯度钙离子的Emax均分别显著低于sham组，shock+drainage0-3h、shock+drainage1-3h组血管环对梯度NE与钙离子Emax均显著高于shock3h组，且shock+drainage1-3h组对梯度NE与钙离子Emax均显著高于shock+drainage0-3h组。研究结果表明，自休克1h起引流肠淋巴流可显著提升大鼠血管反应性与钙敏感性。进一步应用MLCK激动剂SP与shock3h、抑制剂ML-7与shock+drainage1-3h血管环孵育后，在NE浓度为10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L时，SP显著提高了shock3h、ML-7显著降低了shock+drainage1-3h组的血管反应性；在钙离子浓度为10-3 mol/L、3×10-3mol/L、10-2mol/L、3×10-2mol/L时，SP提高了shock3h、ML-7显著降低了shock+drainage1-3h组血管环的钙敏感性；两组大鼠血管环与工具药孵育后，NE为10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L时的血管反应性、在钙离子浓度为3×10-5mol/L、10-4mol/L、3×10-4mol/L时的钙敏感性，两组间均无统计学变化。同时，SP显著提高了shock3h血管环对梯度NE的Emax、对梯度钙离子的Emax、pD2、但仍低于sham组，ML-7抑制了shock+drainage1-3h组血管环对梯度NE与钙离子的Emax、但仍高于shock3h组。研究结果提示，MLCK参与了休克肠淋巴液介导血管低反应性、钙失敏的作用机制。
结论：MLCK在失血性休克后淋巴管收缩性的双相变化中发挥重要作用，以MLCK为切入点，调控休克淋巴管收缩性，可为淋巴管功能障碍性疾病的防治提供了有效的实验依据；引流休克1h肠淋巴液对血管反应性的提升作用强于休克即刻引流，MLCK参与了休克肠淋巴液介导的血管低反应性的改变，研究结果为以休克肠淋巴液、MLCK为靶点，干预休克血管低反应性提出了新思路。