论文部分内容阅读
犬流感(Canine influenza，CI)是由正粘病毒科A型流感病毒属CIV引起的一种犬属动物接触性呼吸道传染病，患犬主要临床症状为发烧、咳嗽、流鼻涕、食欲减退、精神沉郁等。近年来，国内外先后有报道H3N8、H5N1、H1N1以及H3N2亚型流感病毒可跨越品种障碍而感染犬。相关报道指出，H3N2亚型与禽源流感病毒亲缘关系较近，相似性较高，各基因片段均来源于禽源，具有禽源流感病毒的特征。宠物犬作为伴侣动物与人类接触亲密，犬流感对人类的健康存在潜在的威胁。因此，监测犬流感流行情况显得尤为重要。 本研究利用特异性引物扩增犬流感病毒H3分离株的NP基因，将其连接到pMD18-T载体后进行序列测定。将测序正确的克隆质粒酶切后回收NP基因，将其亚克隆到表达载体pGEX-6P-1中，构建了pGEX-6P-1-NP重组表达质粒，将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达后，SDS-PAGE可见在相对分子量73ku左右处出现新的蛋白条带，IPTG浓度为1.0mmol/L，诱导时间为5h时，表达量最高。Western-Blot分析可见，表达的融合蛋白可与CIV阳性血清发生特异性反应，证明表达产物抗原性良好。将诱导后的菌体进行超声破碎，SDS-PAGE可见该融合蛋白全部以可溶形式存在，大量表达后，经亲和层析法纯化后获得了纯度较高的NP蛋白。 以纯化的重组NP蛋白作为检测抗原，建立了检测H3亚型CIV抗体的间接ELISA方法。确定了间接ELISA方法各组分的最适反应条件为：NP抗原浓度为5μg/mL，血清稀释倍数为100倍，二抗稀释浓度5000倍，抗原和血清、血清和二抗都是在37℃条件下反应1小时，阴阳性临界值为0.271。初步建立的间接ELISA检测方法，通过交叉试验、重复性试验验证，表明该方法特异性强、重复性好。与HI作对比实验，同时对临床采集的血清进行检测，检测结果表明建立的ELISA方法的敏感性较高，并且两者的符合率达到95％以上，建立的间接ELISA方法为H3亚型犬流感病毒抗体检测提供了一种快速、准确、简便的方法。