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在甾体药物的合成中，为了满足绿色发展的需求，微生物转化逐步替代化学催化。利用酶催化的方法在温和条件下生产甾体药物中间体逐渐成为研究的热点。在本文的工作中，我们对甾酮C1,2位脱氢酶进行了系统的研究。 尽管目前甾酮C1,2位脱氢酶的研究比较多，但是依然存在很多的问题，如酶活力不高，蛋白可溶性表达不好，催化底物浓度较低，催化机理尚不清楚等等。我们在NCBI数据库中通过基因挖掘得到了5个甾酮C1,2位脱氢酶，结合从实验室保藏的菌株中克隆得到的9个酶，构建了一个小型的酶库，随后将这些酶在大肠杆菌中进行异源表达测定活性，得到了8个有活力的酶，从中选取6个活力较高的酶进行底物谱的分析。结果表明，不同来源的甾酮C1,2位脱氢酶具有不同的底物偏好性，底物分子中的取代基的位置和类型严重影响着酶的催化活性，底物C-21位上含有羟基，比含有醋酸酯活性要高，两者的活性又比含有甲基的活性高。甾体母核上C9-C11位上含有双键可能降低酶的催化活性。底物C-17位上的乙酰基对催化活性有重要影响，C-17位上的羟基对酶活有抑制作用。 通过以上研究发现，MsKstD1和ReKstD具有较好的催化活性。两者在水溶液中均是以单聚体的形态存在，最适温度分别为25℃和30℃，最适pH为50mMTris-HCl pH8.0，酶学性质分析显示两者稳定性较好，在4℃保存一周左右，活力残留约80％。MsKstD1对9-OH-AD的亲和力最高（Km为36.9±4.6μM），对孕酮催化效率最高(1.9×106S-1M-1)。ReKstD对脱氧可的松展现出最高的亲和力（17.3±0.81μM）和催化效率(1.7×106S-1M-1)。为了得到较高的产率，系统的考察了影响反应进程的各个因素，结果表明，O2的存在可加速反应进程，PMS是一种较好的电子受体，DMSO是一种良好的助溶剂，该酶对DMSO的耐受性可达40％(v/v)左右。在检测范围内，MsKstD1未检测到明显的底物及产物抑制;对ReKstD而言，有明显的底物、产物抑制。这是首次对反应过程中的参数进行系统的优化及控制。随后利用MsKstD1转化10g/L底物，反应3h获得7.6g/L泼尼松龙，得到目前文献报道中最高的时空产率2.53g/L/h。 最后，利用半理性设计的方法对ReKstD进行活性改造，以6α-Methyl化合物为底物，对突变体筛选后，得到了对该底物有活性的突变体F116W。实现了对该底物活力“从无到有”质的飞跃，对野生型及F116W进行分子动力学模拟，结果显示F116W突变体中FAD上的N5与底物分子C-1原子上的α-H距离≤2.5(A)，符合发生催化的条件，且该突变体与底物的结合自由能为4.6kcal·mol-1，使底物更易于与F116W反应，与实验结果相一致。以上实验显示，通过对该酶进行改造，有希望获得具有不同底物偏好性的甾酮C1,2位脱氢酶。 通过对克隆得到的甾酮C1,2位脱氢酶系的研究，更加深入的了解其催化机理，为泼尼松龙等药物的合成提供新的途径。