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烟草是重要的经济作物和科研模式植物。烟草在生长过程中产生非常丰富的次生代谢产物，如生物碱、酚类和萜类等化合物，这类物质的产生是烟草在长期进化中对生态环境适应的结果，它们在烟草抵御昆虫的侵袭、增强抗逆、抗病等方面起着重要作用。同时，烟草的次生代谢物质已被广泛应用在医药、食品和农药等领域。作物一种特殊而又重要的经济作物，从某种程度上说，烟草的使用价值和经济价值与它的次生代谢产物密切相关。因此，开展烟草次生代谢工程和代谢调控的研究有着重要的意义，其中，通过基因工程技术进行次生代谢物质的转运与积累的研究是调控次生代谢物质的有效途径。烟草次生代谢物质种类繁多，但其在次生代谢物质的转运与积累方面的研究相对滞后。ABC（ATP—Binding Cassette）转运蛋白是广泛存在与自然界生物体中的一类超家族跨膜蛋白。ABC转运蛋白在植物次生代谢物质的转运与积累过程中扮演重要的角色，已经成为近年来植物次生代谢工程重点研究方向之一。为了从分子水平研究烟草ABC转运蛋白对次生代谢物质的转运与积累的机制，本研究对烟草基因组范围内ABC转运蛋白进行了系统的分析，并针对烟草次生代谢物质转运的功能研究等方面开展了一系列的工作，主要结果如下：①基于栽培烟草品种红花大金元的基因组数据和预测基因，在烟草基因组中鉴定到265个ABC基因，约占烟草基因总数的0.4%，这是目前已知生物体中最大的ABC转运蛋白家族。对烟草ABC转运蛋白进行了家族分类、命名、结构形式以及亚细胞定位等基本信息的分析，其中，ABCG亚家族是烟草最大的ABC亚家族，占烟草总ABC基因的56%，是目前植物ABC亚家族中成员最多，占比例最大的亚家族；ABCE亚家族仅含有2个ABC蛋白，是烟草最小的ABC亚家族。②分析比较了烟草ABC基因与其它物种ABC基因的系统进化关系。结果表明烟草ABCA亚家族基因的进化速度较快，物种间的直系同源关系不明显，烟草ABCE亚家族最保守，而ABCC和ABCG亚家族基因呈现出明显的物种特异性扩增现象；另外，从大多数烟草ABC亚家族中鉴定到了一些其他植物中已知功能的ABC同源基因。③基于烟草ABC转运蛋白的数据，筛选并克隆了一个参与烟碱转运的候选基因－NtWBC13，属于ABCG亚家族，编码一个半分子的ABC转运蛋白，膜蛋白亚细胞定位软件分析结果显示，NtWBC13定位在细胞膜上；半定量PCR和qRT-PCR分析发现，NtWBC13基因的转录水平受烟碱、茉莉酸甲酯（methyljasmonate，MeJA）和损伤处理的诱导；多序列比对结果表明，NtWBC13与其他植物WBC蛋白的氨基酸序列在Walker A、Walker B以及ABC标签基序处高度保守。④利用qRT-PCR技术分析了烟草NtWBC13的组织表达模式，发现其在的根中有较高的表达量；克隆了NtWBC13的启动子序列，启动子数据库软件分析结果显示，NtWBC13启动子区域存在多个参与损伤应答的元件CATG-box（CATG）、W-box（TCACC/T）和根系优势表达的元件ROOTMOTIFTAPOX1（ATATT）；构建了pNtWBC13/GUS的表达载体，经Gus组织化学检测发现，在烟草主根部位有明显GUS信号，表明NtWBC13可能在根部发挥着重要的作用。⑤为了检测NtWBC13是否具有转运烟碱的功能，将烟草NtWBC13异源表达在酵母表达系统中，在添加有烟碱的培养基中培养，通过提取酵母中的烟碱，经HPLC检测发现，在不同浓度的烟碱培养条件下，与对照株相比，NtWBC13酵母转化株具有较强的烟碱转运能力；不同时间段的积累结果也表明，NtWBC13酵母转化株同样具有较强的积累烟碱的能力。通过RNAi技术降低烟草中NtWBC13基因的表达量之后，干扰株根部的烟碱积累能力降低；当在培养基中添加了烟碱后，发现后代干扰株系种子的萌发和生长能力受到不同程度的抑制。以上结果表明NtWBC13是一个烟碱转运蛋白，很可能在烟草主根部位调控烟碱的积累过程。⑥独脚金内酯是一类新型植物激素，最近发现其具有抑制植物侧枝发育的功能。基于矮牵牛独脚金内酯转运蛋白PhPDR1的序列，通过比对搜索烟草ABC转运蛋白数据，在烟草中鉴定了一个与矮牵牛PhPDR1高度同源的蛋白－NtPDR6。通过分段克隆法拼接得到全长序列，并对其进行了生物信息学的分析，NtPDR6属于烟草ABCG基因亚家族，具有植物PDR蛋白典型的“NBD-TMD”反向结构特征。多序列比对分析表明，NtPDR6与植物PDR蛋白的氨基酸序列在Walker A、Walker B和ABC标签基序位点处高度保守。亚细胞定位分析软件将其定位在细胞膜上。通过进化分析显示，烟草NtPDR6与PhPDR1互为直系同源蛋白，两者的氨基酸序列相似度高达93%。⑦利用qRT-PCR技术调查了经低磷和生长素处理后的NtPDR6基因表达情况，分析发现NtPDR6转录水平受低磷和生长素的显著诱导上调。不同组织的表达分析结果显示NtPDR6在根中的表达量最高，茎中次之，而在叶和花中的表达量很低。克隆并分析了NtPDR6基因启动子的序列，发现在启动子区域存在1个低磷应答的Pho-like元件（GACGTGG）和4个根系优势表达的元件ROOTMOTIFTAPOX1（ATATT）。NtPDR6启动子驱动的GUS基因表达分析结果显示，在侧根表皮细胞、根尖分生区以及近地面区茎部的侧芽区有较强GUS信号；低磷处理可以进一步增强GUS信号。NtPDR6基因与矮牵牛PhPDR1基因表达模式相似，推测NtPDR6很可能与PhPDR1有着相似的基因功能。⑧通过RNA干扰技术降低NtPDR6基因表达量后，干扰株的分枝明显增加，且随着植株的生长，分枝表型越明显。该表型与独脚金内酯合成基因被突变或干扰，以及矮牵牛PhPDR1被干扰之后的表型一致，这是由于独脚金内酯的缺少而导致的植物抑制分枝能力的降低所引起的。研究表明烟草NtPDR6很可能参与独脚金内酯的转运过程。本课题从基因组水平上研究了烟草基因组中ABC转运蛋白的基因数目、结构域特点和亚细胞定位以及烟草ABC基因与其它植物ABC基因的相互进化关系，这为了解ABC转运蛋白基因在烟草中的进化地位和功能多样性提供了理论基础和分子依据。同时，我们还开展了ABC转运蛋白对烟草次生代谢物质转运的功能研究，分别克隆并研究了一个参与烟碱转运的基因NtWBC13和一个独脚金内脂转运的基因NtPDR6，这为烟草次生代谢物质调控的研究提供了有利线索，也为其他植物次生代谢物质的调控提供了参考依据。