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研究背景白血病(leukemia)是造血系统的恶性疾病,是小儿恶性肿瘤中发病率最高的一种,亦是儿童时期的主要死亡原因之一。小儿白血病90%以上为急性白血病,其中急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)约占2/3。近20年来,小儿急性白血病的治疗有了很大进展,尤其是ALL,其5年无事生存率(Event Free Survial,EFS)达到70%～80%。目前为止,白血病有效的治疗方法是化疗。然而部分患者在初始治疗对化疗药物不敏感或经历了初始有效的治疗后仍将复发,其中最重要的原因就是白血病细胞对化疗药物产生了耐药性。化疗药物诱导的肿瘤细胞凋亡受阻常常是肿瘤细胞耐药的重要机制。耐药是成功治疗白血病的主要障碍,成为白血病治疗领域的难题。骨髓造血微环境(hematopoietic microenviroment,HM)在白血病耐药中的作用愈来愈受到人们的重视,近十年来,人们对HM的研究取得了长足的进展,现在推测,造血微环境引起肿瘤耐药的主要途径为肿瘤细胞直接粘附导致的耐药(CAM-DR)和可溶性细胞因子介导的耐药、抗凋亡引起的耐药(SM-DR)。HM除了主要由骨髓基质细胞、细胞外基质和细胞因子组成外,HM中还含有少量的骨髓间充质干细胞(MSCs),MSCs为骨髓基质细胞的前体细胞,是骨髓中除了造血干细胞以外的一类干细胞。MSCs特征性表达CD29、CD44、CD73、CD105、CD166和HLA-A/B/C。在体外特异的培养条件下具有多向分化的潜能,并产生多种调节造血的细胞因子和生长因子,如IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、M-CSF等,虽然MSCs在骨髓中含量不多(占1/万～0.1万),但近年来研究发现它对造血起重要的调控作用。正常MSCs在机体正常造血发生过程中起重要作用,通过分泌可溶性细胞因子、细胞表面粘附分子、直接粘附等影响造血干细胞的增殖、分化、生存。研究结果提示, MSCs参与了白血病的发生、发展过程,并与白血病细胞的耐药、抗凋亡等特性有关;同时对B淋巴细胞祖细胞和B淋巴细胞白血病细胞的增殖、分化、生存均有重要影响。在对髓系白血病的研究中发现,正常人MSCs降低白血病细胞对化疗药物的敏感性,从而发挥其对白血病细胞的保护作用。基于MSCs能使白血病细胞免于药物诱导的凋亡,学者们称骨髓基质微环境为白血病细胞逃避常规化疗的“避难所”。但目前大多数研究集中在正常MSCs和已建系的基质细胞,而对于发生造血实质细胞恶性克隆变白血病儿童的MSCs研究尚无。造血微环境抑制药物诱导白血病细胞凋亡的作用虽然得到肯定,但其相互作用,环节众多,错综复杂,难以彻底、系统的阐明参与其中的各种成分的具体作用及他们之间相互影响的细节。而在儿童急性淋巴细胞白血病中,患儿MSCs与白血病细胞之间相互作用在白血病细胞获得耐药、抗凋亡特性的过程的机制,尚待深入研究。因此,应用一种新的研究方法探索其机制,将推动此领域的深入研究,将有助于阐明ALL患儿MSCs保护白血病细胞获得耐药和抗凋亡特性的作用机制。研究目的1.探讨ALL儿童MSCs体外分离、扩增的方法。2.研究ALL儿童MSCs对白血病细胞株K562及耐阿霉素的K562/AO2增殖的影响,明确MSCs调控白血病增殖的特点。3.分析与MSCs粘附的白血病细胞对化疗药物敏感性变化及探讨其调控机制,为进一步研究白血病耐药提供实验依据,为临床提供帮助。研究内容1. ALL儿童MSCs的体外分离、培养及鉴定。2. MSCs与白血病细胞株K562、K562/AO2粘附共培养对白血病细胞增殖的影响。3.与MSCs粘附共培养的白血病细胞对化疗药物敏感性变化的研究。4. MSCs诱导K562、K562/AO2细胞发生耐药机制的研究。研究方法1、ALL儿童骨髓2～5ml,分离、扩增、鉴定,以获得足量的MSCs。2、实验分4组:1组白血病细胞株K562细胞单独悬浮培养组;2组K562细胞与MSCs粘附共培养组;3组耐ADM型白血病细胞株K562/AO2细胞单独悬浮培养组;4组K562/AO2细胞与MSCs粘附共培养组。3、4组细胞培养6天,计数各组白血病细胞的增殖情况。4、流式细胞仪检测各组白血病细胞的细胞周期情况。5、1、2组白血病细胞,3、4组白血病细胞分别加入不同浓度的ADM作用24h,流式细胞仪检测各组白血病细胞的早期凋亡率。6、各组白血病细胞提取RNA,FQ-PCR检测mdr1基因及RT-PCR检测Bcl-2和Bax基因。技术路线研究结果1.建立了比较成熟的ALL儿童MSCs体外分离、扩增方法。2.粘附生长的白血病细胞增殖缓慢,没有明显的对数生长期。3.流式细胞仪测定细胞周期,与单独悬浮培养的K562细胞相比,与MSCs粘附共培养的K562细胞G0-G1期细胞增多(P<0.05),S期细胞减少(P<0.05),而G2-M期细胞无显著变化(P>0.05);MSCs粘附共培养的K562/AO2细胞与单独悬浮培养的K562/AO2细胞相比,G0-G1期细胞增多(P<0.05),S期细胞减少(P<0.05),而G2-M期细胞无显著变化(P>0.05)。4. 2组K562细胞加入同浓度ADM,2组K562/AO2细胞加入同浓度ADM作用24小时后,收集细胞测定的早期凋亡率显示,早期凋亡细胞单独悬浮培养的K562细胞早期凋亡细胞要明显多于粘附共培养的K562细胞(P<0.05);单独悬浮培养的K562/AO2细胞中早期凋亡细胞要明显多于粘附共培养的K562/AO2细胞(P<0.05)。5.采用FQ-PCR技术,单独悬浮培养的K562细胞和粘附共培养的K562细胞都没有mdr1基因的表达;单独悬浮培养的K562/AO2细胞和粘附共培养的K562/AO2细胞都有明显的mdr1基因的表达,但2组K562/AO2细胞mdr1表达无显著差异性(P>0.05)。采用RT-PCR技术,粘附共培养的K562细胞检测Bcl-2基因相对表达要明显强于单独悬浮培养的K562细胞(P<0.05);而Bax基因的相对表达两组无显著差异(P>0.05);粘附组K562细胞Bcl-2/Bax与单独悬浮组比较有显著差异(P<0.05);共培养的K562/AO2细胞检测Bcl-2基因相对表达要强于单独悬浮培养的K562/AO2细胞;而Bax基因的相对表达两组无显著差异(P>0.05);粘附组K562/AO2细胞Bcl-2/Bax与单独悬浮组比较有显著差异(P<0.05);K562/AO2细胞Bcl-2基因相对表达要强于K562细胞(P<0.05)。结论1.与ALL儿童MSCs共培养的白血病细胞株K562和K562/AO2细胞对ADM的敏感性降低,凋亡率下降。2.与ALL儿童MSCs粘附共培养,可以阻滞白血病细胞株K562和K562/AO2细胞周期进程,使大部分细胞停留在G0-G1期。3.白血病细胞株K562和K562/AO2对ADM产生耐药性可能与粘附共培养后Bcl-2基因表达增强有关,与MSCs粘附培养并没有使白血病细胞多药耐药基因mdr1的表达量增加。