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柳珊瑚(Gorgonian)是指属于腔肠动物门(Coelenterata)、珊瑚虫纲(Anthozoa)、八放珊瑚亚纲(Octocorallia)、软珊瑚目(Alcyonacea)的硬轴珊瑚亚目(Scleraxonia)、全轴珊瑚亚目(Holaxonia)和钙轴珊瑚亚目(Calcaxonia)中珊瑚的珊瑚统称。柳珊瑚是重要的海洋药用动物。本研究对我国海南三亚湾和湛江徐闻柳珊瑚的资源情况各做了一次补充调查,利用柳珊瑚外部形态特征如群体外部特征(颜色、分枝、珊瑚萼的大小和分布情况)和骨针特征(骨针形状、大小和颜色)进行了分类鉴定研究,发现许多新记录种;通过2种样品前处理方式和4种不同的DNA提取方法相结合,提取柳珊瑚Echinogoriaaurantiaca(Valenciennes)基因组DNA,并对其18SrRNA基因进行了克隆和序列分析,比较研究了哪一种方法更容易提取DNA;同时对4种中国柳珊瑚的18SrDNA基因进行了测序,结合从Genbank中搜索到的另外24条柳珊瑚序列构建柳珊瑚系统发育树,进行了柳珊瑚分子系统学研究。主要内容与结果如下:
1.三亚湾双帆石(间于东岛和西岛之间)柳珊瑚资源情况调查。共得到柳珊瑚12种,分别属于5科8属。同时,根据柳珊瑚形态结构特征,研究了三亚湾柳珊瑚系统分类关系。其中BebryceindicaThomoson,1905为新记录。
2.湛江徐闻柳珊瑚资源情况调查。这是第一次系统报道徐闻柳珊瑚的资源,共得到柳珊瑚16种,分别属于7科14属。根据柳珊瑚群体颜色及骨针的形态学特征系统阐述了徐闻灯楼角柳珊瑚的系统分类关系。本次研究结合国际上最新的柳珊瑚分类系统,对国内原有的形态分类作了修正,这更将促进中国柳珊瑚资源情况为国际上认同和了解。丛柳珊瑚Paraplexaurasp.、Dichotellasp1,Dichotellasp2为新记录属,鞭柳珊瑚EllisellamaculataStuder,1878,为新记录。
3.几种不同柳珊瑚DNA提取方法的比较研究。由于柳珊瑚DNA非常容易降解,难以提取,本研究通过2种样品前处理方式和4种不同的DNA提取方法相结合,提取柳珊瑚Echinogoriaaurantiaca(Valenciennes)基因组DNA,并对其18SrRNA基因进行了克隆和序列分析。实验结果表明,对于2种样品前处理方式,采用纯酒精进行样品前处理比PBS(磷酸缓冲液)进行样品前处理效果要好。在4种不同的DNA提取方法中,以CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取基因组DNA效果最好,其余三种方法如PVP(聚乙烯基吡咯烷酮)法,高盐法和酚/氯仿法的提取效果较差。并且不同样品的钙质沉淀对DNA都有一定程度的吸附。另外,本研究通过PCR扩增、克隆测序得到柳珊瑚18SrRNA基因序列,并将其序列与Leptogorgiachilensis的18SrRNA基因序列在DNA序列上和RNA二级结构上对比分析。结果表明,柳珊瑚18SrRNA基因序列非常保守,其变异率为1.21%。RNA二级结构也非常保守,两者大部分茎环结构表现相同,少数结构表现出差异性。RNA二级结构对于柳珊瑚的分子系统发育分析可能有一定的参考价值。
4.柳珊瑚18SrDNA基因的分子系统学研究。本研究在国内第一次报道了柳珊瑚18SrDNA基因的分子系统学研究。通过对4种柳珊瑚的18SrDNA基因的测序,结合Genbank中搜索到的24条其他柳珊瑚的18SrDNA序列,构建系统发育树,结果表明柳珊瑚可分为两个进化枝,系统树清楚表明了进化枝一的系统发育关系,但未能很好反映进化枝二的系统发育关系。进化枝一的系统发育关系较为清晰,其中枝鳃珊瑚科、红珊瑚科和拟柳珊瑚科的遗传关系非常紧密,三爪珊瑚科和鞭柳珊瑚科分类地位还待商榷,需要选取更多的样品构建系统树才能弄清楚它们准确的分类地位。进化枝二的系统关系非常混乱,可见18SrDNA基因并不能提供有效的遗传信息,这就需要我们寻求其他遗传标记来解决进化枝二的系统关系。