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目的:1.观察外源性给予Irisin是否能促进LPS诱导的脓毒症小鼠巨噬细胞M2型极化并减轻肺损伤。2.明确Irisin在M2型巨噬细胞抗炎调控中的作用。3.探讨Irisin介导巨噬细胞抗炎反应的潜在分子调控机制。方法:1.建立动物和细胞实验模型。24只雄性C57BL/6J小鼠随机分为四组,正常对照组、Irisin对照组、LPS暴露组和Irisin治疗组。正常对照组小鼠腹腔注射10m L/kg生理盐水,2、26和50 h后分别腹腔注射生理盐水（10 m L/kg）;Irisin对照组小鼠腹腔注射生理盐水（10 m L/kg）,2、26和50 h后分别腹腔注射重组Irisin（0.5μg/kg/day）;LPS暴露组小鼠腹腔内注射LPS（10 mg/kg）,2、26和50 h后分别腹腔注射生理盐水（10 m L/kg）;Irisin治疗组小鼠腹腔注射LPS（10 mg/kg）,2、26和50 h后分别腹腔注射重组Irisin（0.5μg/kg/day）。以上四组处理72 h后,吸入异氟烷麻醉小鼠,眼球取血并收集肺组织。HE染色观察肺组织病理变化,ELISA检测血清及细胞培养上清中炎症因子含量、RT-q PCR法检测炎症因子m RNA表达,Western blot检测炎症因子蛋白表达,免疫荧光检测肺组织中巨噬细胞的数量。Irisin处理巨噬细胞后,CCK-8法检测巨噬细胞活力变化,流式细胞术检测巨噬细胞凋亡变化。体内及体外实验分析Irisin通过促进巨噬细胞抗炎分化改善LPS诱导炎症反应的规律。2.200 ng/m L Irisin分别处理RAW264.7和BMDMs细胞0、6、12、24和48h,Western blot检测PPAR-γ和Nrf2依赖的抗氧化酶蛋白表达,免疫荧光检测巨噬细胞PPAR-γ和Nrf2表达及定位,RT-q PCR法检测Nrf2依赖的抗氧化酶表达,ELISA检测炎症因子含量、SOD2和CAT的酶活性及GSH的含量,流式细胞术检测ROS的水平。使用PPAR-γ抑制剂T0070907、小干扰PPAR-γ和Nrf2抑制剂ML385干预,体内研究Irisin通过激活PPAR-γ和Nrf2调控巨噬细胞抗炎和抗氧化反应的作用机制。3.200 ng/m L Irisin分别处理RAW264.7和BMDMs细胞0、6、12、24和48h,Western blot检测STAT6、p-STAT6蛋白表达,免疫荧光检测巨噬细胞STAT6表达及定位,RT-q PCR法检测STAT6及炎症因子m RNA表达,ELISA检测炎症因子的含量。使用STAT6抑制剂AS1517499或敲减STAT6,观察Irisin通过磷酸化STAT6调控M2型巨噬细胞抗炎分化。双荧光素酶报告基因检测STAT6与PPAR-γ/Nrf2的结合位点,染色质免疫共沉淀检测STAT6与PPAR-γ/Nrf2的结合程度。4.RNA-seq测序分析Irisin作用RAW264.7细胞中JAK家族的差异表达基因,寻找巨噬细胞抗炎分化的关键调控因子。Western blot检测JAK2、p-JAK2及STAT6、p-STAT6蛋白表达,RT-q PCR法检测PPAR-γ/Nrf2、炎症因子及抗氧化酶m RNA表达,ELISA检测炎症因子的含量。使用JAK2抑制剂FLLL32,整合素αVβ5抑制剂Cilengitide或敲减整合素αVβ5观察巨噬细胞M2型标志物的变化。免疫共沉淀分析JAK2和整合素αVβ5是否互作。结果:1.Irisin通过促进巨噬细胞抗炎分化改善LPS诱导的炎症反应。体内研究发现,给予Irisin并未引起肺毒性,但显著减轻LPS诱导的脓毒症小鼠的肺损伤和炎症细胞浸润,降低脓毒症小鼠血清及肺组织中TNF-α和IL-6的水平,升高IL-10和Arg-1的水平。且肺组织中F4/80+CD11c+（M1）巨噬细胞数量减少,F4/80+CD206+（M2）巨噬细胞数量增加。200 ng/m L Irisin刺激RAW64.7和BMDMs细胞0、6、12、24和48 h后,IL-10、Arg-1、CD206等巨噬细胞M2型标志物的表达和分泌均增加,还抑制LPS诱导的促炎因子表达和分泌,促进IL-10和Arg-1的表达和产生。2.Irisin通过激活PPAR-γ和Nrf2信号促进巨噬细胞抗炎分化。给予Irisin增强巨噬细胞中PPAR-γ的m RNA及PPAR-γ磷酸化表达,促进核转位。使用PPAR-γ特异性拮抗剂T0070907减弱Irisin诱导的RAW264.7中PPAR-γ磷酸化的增加,抑制了Arg-1和IL-10的表达和产生。此外,特异性si RNA敲低PPAR-γ显著抑制了Irisin诱导的PPAR-γ、Arg-1、IL-10和CD206的m RNA表达。另一方面,Irisin增加Nrf2磷酸化和核转位,增强Nrf2及其下游抗氧化酶的m RNA和蛋白表达,促进RAW264.7中SOD2和CAT酶活性以及GSH含量增加。并且Irisin处理减弱了RAW264.7中LPS诱导的ROS增加。Nrf2特异性拮抗剂ML385也抑制了Irisin介导的Arg-1和IL-10的表达和产生。3.Irisin通过调控STAT6磷酸化促进PPAR-γ和Nrf2信号激活。在Irisin作用下,STAT6快速磷酸化,且核转位增多。STAT6抑制剂AS1517499预处理阻断RAW264.7和BMDMs细胞中Irisin介导的PPAR-γ和Nrf2转录激活,抑制PPAR-γ下游抗炎细胞因子的积累。使用sh RNA敲低STAT6同样降低了PPAR-γ、Nrf2及其下游基因的m RNA表达。突变的PPAR-和Nrf2组荧光素酶活性被抑制,200ng/m L Irisin可以促进STAT6与PPAR-γ/Nrf2启动子结合增强。4.Irisin通过调控JAK2磷酸化促进STAT6及下游信号激活。Irisin显著提高JAK2 m RNA表达,促进JAK2快速磷酸化。JAK2抑制剂FLLL32减弱Irisin诱导的RAW264.7细胞中JAK2和STAT6磷酸化,抑制PPAR-γ、Arg-1和IL-10 m RNA的增加,同时降低Irisin介导的Nrf2和下游抗氧化基因的m RNA表达。Irisin受体整合素αVβ5抑制剂Cilengitide减弱Irisin诱导的RAW264.7细胞中JAK2和STAT6磷酸化及PPAR-γ、Nrf2、Arg-1和IL-10的m RNA表达增加。同样,敲低整合素αVβ5抑制Irisin处理的RAW264.7细胞中PPAR-γ、Nrf2、Arg-1和IL-10 m RNA表达增加。200 ng/m L Irisin促进巨噬细胞中JAK2和整合素αVβ5的相互作用。结论:1.Irisin通过调节巨噬细胞抗炎分化减轻LPS诱导的小鼠急性肺损伤,并增加了M2巨噬细胞标记物的表达,提示其可能是一个新型抗炎因子。2.Irisin上调PPAR-γ和Nrf2的表达,促进巨噬细胞向抗炎分化。3.Irisin通过激活STAT6调节PPAR-γ和Nrf2依赖的下游分子表达。4.Irisin可能通过促进JAK2与整合素αVβ5相互作用调控巨噬细胞抗炎分化。