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背景:近年来,在治疗血液系统的恶性肿瘤上虽取得很大的进展,但治疗效果仍不尽人意,多数患者在完全缓解后还会出现复发,并最终死亡。常规化疗只能杀灭增殖周期的细胞,目前单克隆抗体的靶向治疗研究较多,然而很多单克隆抗体没有杀伤肿瘤细胞的能力,抗体对肿瘤相关抗原专一性不强,如果仅针对增殖周期的肿瘤细胞表面标志,或许会取得暂时的明显临床疗效,但因肿瘤干细胞的存在终会导致疾病复发。因此要根除恶性血液肿瘤的前提仍然是弄清不同起源细胞的分子标志,直接针对恶性血液肿瘤干细胞的靶向治疗,从源头上对恶性血液肿瘤进行治疗,可望成为治愈恶性血液肿瘤的一个新策略。
SALL4是一种新发现的含锌指结构的转录因子,是SALL基因家族的成员之一,在胚胎干细胞增殖和胚胎发育中起重要的调控作用。越来越多的研究表明SALL4基因与细胞死亡、癌症、DNA复制/修复有关。正由于SALL4致瘤的潜能和维持干细胞的自我更新和多能性等特性,使人们开始关注它与恶性血液肿瘤发生的关系,从而进一步了解SALL4在血液肿瘤发病机制中的作用。
目前常用的几种检测目的基因表达的方法有:形态学方法,荧光原位杂交(Fluorescence in situ Hybridization,FISH),流式细胞仪等,均存在着检出率较低的弊端,聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)技术可以从105-106正常细胞中检测出一个目的细胞,是公认的比较敏感的检测方法,但传统PCR技术只能做到定性或半定量检查,不能精确定量。一种理想的检测方法应具备如下条件:特异性强,敏感度高,重复性好,快速简便,定量分析。实时荧光定量聚合酶链反应技术(Real-timefluorescent Quantitative PCR,FQ-PCR)的出现为解决这一难题提供了新的思路。
本课题采用FQ-PCR方法检测不同恶性血液肿瘤骨髓细胞中SALL4基因的表达,探索SALL4基因是否为恶性血液肿瘤的标记之一。
目的:1.建立实时荧光定量PCR检测SALL4基因的方法。
2.检测不同类型恶性血液肿瘤患者体内SALL4基因的表达情况。
方法:1.病例病例选自2009年1月至2009年12月海南省人民医院住院患者及门诊体检者,共88例(恶性血液肿瘤患者77例和11例对照者),其中男52例,女36例,年龄13～77岁,平均年龄45.4岁。实验组所有病例经临床及实验室检查确诊,包括:46例原发性白血病患者(急性非淋巴细胞白血病21例,急性淋巴细胞白血病12例,慢性粒细胞白血病13例)、11例骨髓增生异常综合征患者、12例非霍奇金淋巴瘤患者(T细胞非霍奇金淋巴瘤4例,B细胞非霍奇金淋巴瘤8例)、8例多发性骨髓瘤患者。11例健康者骨髓标本为实验对照组。
2.实时荧光定量PCR检测SALL4基因的转录水平。
①患者骨髓标本采集和骨髓中单个核细胞提取。
②单个核细胞中核糖核酸(Ribonucleic Acid,RNA)提取。
③逆转录反应合成互补脱氢核糖核(complementaryDeoxyribonucleic acid,cDNA。)
④常规PCR反应,PCR产物构建质粒标准品。
⑤实时荧光定量PCR方法相对定量检测SALL4基因转录水平。
3.统计学分析所有统计计算均用SAS9.0统计软件处理。P＜0.05认为差别具有统计学意义。
结果:1.SALL4基因在急性非淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、骨髓增生异常综合征中有明显的过表达,与正常对照组比较有统计学意义(P＜0.05)。
2.正常对照组、急性非淋巴细胞白血病组、急性淋巴细胞白血病组、慢性粒细胞白血病组、骨髓增生异常综合征组、非霍奇金淋巴瘤组、多发性骨髓瘤组七组间SALL4基因定量表达的差异有统计学意义(x2=27.1,P＜0.01)。
3.多发性骨髓瘤患者和正常对照组的SALL4基因表达水平无显著性差异(P＞0.05)。
结论:1.FQ-PCR方法具有敏感性高,特异性强,重复性和稳定性好等优点,是进行目的基因检测的一种快速简便,定量准确的方法。我们已成功构建了FQ-PCR检测SALL4 mRNA表达水平的方法。
2.SALL4在部分恶性血液肿瘤的发生过程中可能起着十分重要的作用。而SALL4对恶性血液肿瘤预后判断是否有价值有待进一步研究。
3.SALL4有可能成为治疗恶性血液肿瘤的一个潜在的分子靶点。