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第一部分：KLF14基因在心肌肥厚表达和功能的细胞实验研究 【研究目的】 心肌肥厚是心脏对慢性压力或容量超负荷产生的一种代偿反应，它的基本变化包括心肌细胞的肥大和非心肌细胞的增殖、增生[1-2]。本部分首先构建KLF14腺病毒，通过异丙肾上腺素（Isoprenaline,ISO）刺激体外培养的新生大鼠原代培养心肌细胞建立肥大模型，然后通过用KLF14腺病毒转染新生大鼠原代心肌细胞，观察相关指标的变化，探讨KLF14基因在心肌细胞中的表达情况，探讨KLF14过表达在心肌细胞肥大的功能，为研究KLF14在动物心肌肥厚中的功能打下坚实基础。 【研究方法】 1．大鼠KLF14腺病毒构建 1.1大鼠腺病毒重组质粒的构建 在NCBI中查询到大鼠KLF14基因序列，并据此人工合成kLF14对应的基因组片段。配制BamHI和EcoRI双酶切体系，分别酶切pHBAd-MCMV-RFP载体和KLF14基因并胶回收。取2ul处理好的酶切后KLF14片段，100-200ng酶切后载体，2ulligasebuffer，1ulT4ligase，加灭菌双蒸水至20ul配成连接液16℃过夜得到pHBAd-MCMV-RFP-KLF14重组质粒。重组质粒经PCR鉴定和测序后通过大肠杆菌扩增。 1.2KLF14腺病毒包装及滴度测定 用pHBAd-MCMV-RFP-KLF14重组质粒和pHBAd-BHG骨架质粒，在293细胞中包装成pHBAd-MCMV-RFP-KLF14腺病毒。大量扩增后收毒，测定阴性对照RFP腺病毒和KLF14腺病毒滴度，分装后-80℃保存备用。 2．心肌细胞肥大时，KLF14表达及功能研究 采用体外心肌细胞原代培养技术，培养出生1-3天的SD乳鼠心肌细胞，用ISO刺激诱导心肌细胞肥大模型。设立对照组（给予灭菌蒸馏水）及不同刺激时间的ISO刺激组。采用RT-PCR法比较各组细胞间KLF14mRNA、BNPmRNA的表达变化情况。 3．KLF14过表达在心肌细胞肥大中的功能研究 3.1原代培养新生SD大鼠心肌细胞，48h后转染不同感染倍数（MOI）KLF14表达腺病毒，使用流式细胞仪及CCK8，检测细胞转染率及活力情况以选择合适转染倍数。 3.2设置以下分组：①KLF14腺病毒组②KLF14腺病毒+ISO组③RFP腺病毒组④RFP腺病毒+ISO组。采用RT-PCR检测各组BNPmRNA及KLF14mRNA的表达变化情况。 【结果】 1.成功构建pHBAd-MCMV-RFP-KLF14过表达质粒，联合骨架质粒pHBAd-BHG转染293T细胞后得pHBAd-MCMV-RFP-KLF14腺病毒，293T细胞中的腺病毒拍照呈红色荧光。改进的TCID50法计算，构建的pHBAd-MCMV-RFP腺病毒滴度2×1010PFU/ml，pHBAd-MCMV-RFP-KLF14腺病毒滴度1×1010PFU/ml。 2.流式细胞学检查，KLF14腺病毒转染心肌细胞转染率。综合考虑KLF14腺病毒转染心肌细胞的转染率和CCK8检测腺病毒对心肌细胞活力影响，转染心肌细胞时，我们选择KLF14腺病毒的MOI=20，RFP腺病毒的MOI=10。 3.KLF14在SD乳鼠心肌细胞中低丰度表达。用ISO刺激心肌细胞30分钟，KLF14基因表达量开始升高，以4h为最高，差异有统计学意义（P<0.05）；刺激24h后KLF14的表达量下降至对照组水平，与对照组无明显差异。 4单纯ISO刺激组较对照组的BNPmRNA明显上调，差异有统计学意义（P＜0.05）。.单纯转染KLF14腺病毒较单纯转染RFP腺病毒BNPmRNA较对照组无明显变化。KLF14腺病毒联合ISO刺激组较单纯ISO刺激组（P＜0.05）和RFP腺病毒联合ISO刺激组中（P＜0.05）BNPmRNA明显上调,差异有统计学意义。 【结论】生理情况下，KLF14在心肌细胞中低丰度表达。在心肌细胞病理性肥大情况下表达升高，转染腺病毒表达载体使KLF14在乳鼠心肌细胞中过表达可以促进ISO诱导的心肌细胞肥大加重。 第二部分KLF14基因在心肌肥厚中表达和功能的动物实验研究 【研究目的】 第一部分实验明确KLF14基因过表达促进心肌细胞肥大的作用以后，因心肌细胞仅是心肌的部分成分，心肌还含有成纤维细胞等非心肌细胞，另外机体内有复杂的神经体液调节机制，因此还需要整体实验来研究KLF14基因在动物心肌肥厚中的表达和功能。本部分皮下埋置预装ISO的微渗透泵刺激小鼠建立小鼠心肌肥厚模型，KLF14转基因小鼠实现KLF14过表达，通过与对照组小鼠相比，转基因小鼠在超声心动图，心室组织切片HE染色、WGA染色及RT-PCR时KLF14mRNA等指标变化情况，探讨KLF14基因在动物心肌肥厚中的表达和功能情况。 【研究方法】 1.小鼠心肌肥厚模型的建立 野生型FVB小鼠随机分成两组，ISO组皮下埋置预装ISO微泵，PBS对照组皮下埋置预装等量PBS的微泵，按30mg/kg/d剂量刺激14天，行超声心动图及心室组织切片HE染色、WGA染色情况了解心肌肥厚模型是否成立，比较ISO组和PBS组的KLF14mRNA表达情况。 2.KLF14在心脏过表达可导致心肌肥厚 KLF14转基因FVB小鼠与野生型FVB小鼠喂食相同的水和饲料，12月后处死后提取心室组织RNA行RT-PCR比较两组KLF14mRNA表达水平。行超声心动图检查、心室组织切片HE染色、WGA染色了解心室肥厚情况。 【结果】 1.KLF14在正常心肌组织中低丰度表达。 2.与PBS对照组相比，14天后埋泵组ISO组M型超声心动图下左心室收缩后壁厚度（LVPWs）、左心室舒张后壁厚度（LVPWd）、左心室收缩前壁厚度（LVAWs）增加（p＜0.05），心室组织切片HE染色示心肌组织增厚，左心室腔变小，心脏出现向心性肥厚，WGA染色示心肌细胞膜表面积增大，差异有统计学意义：说明小鼠心肌肥厚模型造模成功。RT-PCR结果ISO组KLF14mRNA表达量上升，提示心肌肥厚时KLF14表达量上调。 3.提取小鼠心室组织RNA行RT-PCR,与野生型组小鼠相比，KLF14转基因组小鼠较野生型组小鼠KLF14mRNA表达量明显增高，差异有统计学意义（p＜0.05）。KLF14转基因小鼠较野生型小鼠超声心动图、心肌组织切片HE染色示心肌组织增厚，左心室腔变小，心脏出现向心性肥厚，WGA染色示心肌细胞膜表面积增大，提示KLF14基因过表达对小鼠产生一种类似皮下埋置预装ISO微泵的功能，能促进小鼠心肌肥厚的发生、发展。 【结论】生理情况下，KLF14在心肌组织中低丰度表达，当动物心肌肥厚时KLF14在心肌的表达量上调。在动物整体水平上，KLF14过表达能促进小鼠心肌肥厚的发生发展。