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去整合素(disintegrin)是一类来源于蛇毒蛋白的小分子量蛋白质，这类蛋白质在氨基酸序列上有高度的相似性，它们均由49～84个氨基酸组成，序列中含有8～14个半胱氨酸(cystine)，形成4～7对二硫健，都含有一个RGD(Arg-Gly-Asp)环(loop)，这些蛋白质利用其RGD序列和整合素(integrin)结合，因而竞争性的抑制整合素和相应配体的结合，使得整合素的功能被抑制。基于去整合素可以与相关整合素(αⅡbβ3、αvβ3、α5β1等)发生特异结合，从而阻断由整合素介导的多种生理病理反应，近年来已经成为医学研究的热点，特别是在抑制血栓形成、抑制肿瘤转移、抑制新生血管的生成、防治骨质疏松等领域。越来越多的人们开始致力于去整合素药物的研究与开发。如何选择合适的去整合素作为研究对象，开发新一代抗栓、抗癌药物是许多研究机构多年来一直努力和奋斗的目标，作为分子量较小的Echistatin以其活性高、免疫原性小成为主要研究对象。
但是，由于去整合素主要是通过其RGD序列识别αⅡbβ3、αvβ3等多种整合素从而发挥作用。而αⅡbβ3主要存在于活化的血小板上，αvβ3主要表达于新生血管内皮细胞和破骨细胞上，在多种肿瘤细胞上也有表达，因此去整合素介导的生物效应作用广泛但不特异。尽管去整合素独特的结构特征理论上可以治疗多种相关疾病，但从临床治疗考虑，我们仍然希望能够得到性质特异，作用专一的去整合素药物。目前已有研究发现去整合素中RGD周围序列的不同会影响其作用的选择性，但具体机制并不清楚。近年来发现含有KGD(Lys-Gly-Asp)的去整合素更倾向于结合整合素αⅡbβ3，选择性抑制αⅡbβ3的功能，但对αvβ3，α5β1结合能力较弱；另外，在研究不同去整合素的结构时发现，当RGD环较宽时，对αIIbβ3的结合能力增强，这些发现为去整合素结构和功能研究提供了新的思路。
实验室自上世纪90年代中期开始研究Echistatin，并取得了一定突破，随着对多种去整合素研究的不断深入，本世纪初，我们将研究重点放在去整合素结构与功能的研究上，课题组根据不同去整合素中RGD/KGD与目的肽段的结合特征，适当改变EchistatinRGD周围的部分氨基酸序列，研究其突变体与相应整合素结合及功能的变化，并根据其功能开发相应基因工程药物，这项研究若能顺利实施，无疑会填补我国在该领域研究的空白，即使与国外同类药物相比，也将会具有多种技术优势。首先我们根据Barbourin含有KGD的结构提出对Echistatin中的RGD进行突变，使其变为KGD；继而根据RGD环变宽时结合αⅡbβ3能力增强的特点将第27位氨基酸突变为W，突变后的RGD模体及周边序列变为AKGDWM，然后利用基因工程技术对Echistatin(AKGDWM)进行制备，探索该突变体的生物学功能，开发活性更高，作用更特异的抗血栓药物;其次，根据rhodostomin突变体特异结合αvβ3的特点，将EchistatinRGD模体及周边序列突变为ARGDNM，探索该突变体的生物学功能，开发作用更加特异的抗肿瘤转移药物。
1.Echistatin(AKGDWM)基因工程新药上游工艺标准化体系研究本部分主要探索Echistatin(AKGDWM)原核表达体系的构建，包括Echistatin(AKGDWM)单独表达体系和融合蛋白表达体系构建，并优化表达条件，通过比较，建立并确定Echistatin(AKGDWM)上游制备工艺的标准化体系，为下游工艺奠定基础。
2.Echistatin(AKGDWM)基因工程新药下游工艺标准化体系研究主要探索Echistatin(AKGDWM)突变体下游制备工艺的标准化研究，包括工程菌高密度发酵工艺的探索和优化，目的蛋白分离纯化工艺研究与优化，并最终建立Echistatin(AKGDWM)下游工艺标准化体系。
3.Echistatin(AKGDWM)基因工程新药药效学研究主要对课题组制备的Echistatin(AKGDWM)突变体进行药效学研究，包括：体外抗血小板聚集活性的检测，血小板聚集量效和时效关系研究，血栓形成抑制实验及CAM新生血管抑制实验研究，以期探讨其蛋白结构与功能的关系。
在Echistatin(AKGDWM)对ADP活化的体外血小板聚集抑制实验中，得出血小板聚集的IC50约为60.42nM，低于天然Echistatin抑制血小板聚集的IC50(130nM)。
在血小板聚集量效关系研究中，Echistatin突变前后抑制聚集活性均呈剂量依赖关系，在相同剂量下，突变体Echistatin(AKGDWM)抑制血小板聚集活性高于天然Echistatin；在抑制血小板聚集时效关系研究中，给药40min，Echistatin抑制作用已经下降，而突变后的Echistatin(AKGDWM)在160min时尚有60％的活性。在抑制血栓形成实验中也得到了相同的结论。
4.Echistatin(ARGDNM)基因工程上游工艺标准化体系研究课题组根据rhodostomin突变体特异结合αvβ3的特点，通过定点突变EchistatinRGD模体周边序列，使其突变为ARGDNM，根据已经建立的Echistatin(AKGDWM)突变体生产工艺(见第一篇内容)，建立Echistatin(ARGDNM)突变体基因工程新药上游生产工艺标准化体系。
5.Echistatin(ARGDNM)基因工程下游工艺标准化体系研究课题组建立的Echistatin(AKGDWM)工程菌发酵工艺、融合蛋白分离纯化工艺是经过大量实验摸索，优化多种条件的基础上建立并加以完善形成的。我们应用已经建立的高密度发酵工艺和分离纯化工艺(参见前述Echistatin(AKGDWM)基因工程新药下游工艺标准化体系研究)，对Echistatin(ARGDNM)突变体工程菌进行高密度发酵，并应用DEAE阴离子交换层析分离纯化融合蛋白，获得了较高的细菌得率(112g/L)和较高的蛋白产量(每克湿菌获突变体蛋白约19.23mg)。因此Echistatin(ARGDNM)突变体下游工艺的研究完全可以参照Echistatin(AKGDWM)突变体的下游工艺，这不仅说明了先前建立的基因工程上下游工艺的稳定性和可靠性，而且利用一套成熟的基因工程制备体系制备生产两种(包括Echistatin有三种)蛋白，体现了经济节约的原则，这既符合大规模生产新药的技术要求，也最大限度的降低了生产成本。为类似多肽类药物的研究与开发提供了思路和方法。
6.Echistatin(ARGDNM)基因工程新药药效学研究主要对课题组制备的Echistatin(ARGDWM)突变体进行药效学研究，其内容与前面设计的药效内容一致。经过比较，Echistatin(ARGDWM)突变体抑制血小板聚集的IC50为226.03nM，抑制CAM血管新生的IC50为8.69nM，这一研究结果证实了突变后的Echistatin(ARGDWM)更倾向于结合αvβ3，识别并结合αIIbβ3的能力下降，这为后续临床前研究奠定了基础，对于研究与开发作用更加特异、疗效更加确切的去整合素药物具有重要的指导意义。
7.Echistatin(AKGDWM)突变体多顺反子原核串联表达体系构建本部分根据原核生物mRNA多顺反子的特点，以Echistatin(AKGDWM)DNA序列为例，通过在目的基因5’端设计SD间隔序列和起始密码ATG，在目的基因3端设计终止密码TAA(或TAG)。在每一顺反子前设计合适酶切位点使目的基因以三拷贝串联方式排列，每一拷贝都有独立的起始密码和终止密码，拷贝之间有设计的SD间隔序列，探索通过设计SD间隔序列，利用串联方式对小分子多肽进行高效表达，以期解决小分子多肽难以单独高效表达的问题，为开发利用小分子多肽药物提供一种全新的思路和方法。