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石斑鱼隶属鮨科(Serranidae)、石斑鱼亚科(Epinephelinae),为广泛分布于热带和亚热带海域、暖水性礁栖的名贵海产鱼类。过度捕捞和栖息地破坏,使石斑鱼自然资源出现衰退迹象。近年来,石斑鱼类的人工养殖发展迅速,一些种类(如斜带石斑鱼)已成为我国南方重要的养殖鱼类。然而,目前石斑鱼的养殖是在忽略物种遗传背景下进行的,尚未见人工养殖对种质影响的研究报道;而作为我国石斑鱼主要养殖基地的广东省,石斑鱼养殖群体遗传背景的研究也呈空白。除此之外,石斑鱼类在种类鉴定、分类地位以及系统进化等方面都存在许多争论。
本研究以斜带石斑鱼为代表的13种石斑鱼类为主要研究对象,利用随机扩增多态DNA(RandomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)和线粒体基因序列分析(Mitochondrialgenesequencing)技术,检测核基因和核外基因的遗传变异,从三个层面(种内遗传变异、种间亲缘关系以及科属间系统进化)逐层深入的探讨,为解决石斑鱼类上述存在的种种问题做一努力和尝试。
研究主要包括如下两个部分:
一、斜带石斑鱼的遗传多样性分析
应用随机扩增多态DNA(RAPD)和线粒体细胞色素b(Cytb)基因序列,从不同世代群体、不同养殖群体、不同种之间进行斜带石斑鱼的遗传多样性分析,探讨人工养殖对遗传多样性的影响程度及机理,并提出相应的保护策略。
1)斜带石斑鱼世代群体间的遗传多样性分析
利用随机扩增多态DNA(RAPD)技术分析了斜带石斑鱼繁育亲本以及2001、2004年孵育的两批子代群体的遗传多样性。17个引物共扩增出104个位点。应用生物软件POPGENE进行统计分析,三个取样群体的多态位点百分率分别为32.69%(繁育亲本)、30.77%(2001年子代)和24.04%(2004年子代);基因多样性和香侬信息指数均为繁育亲本群体最高(0.1108和0.1670)、2004年子代群体最低(0.0666和0.1038)。通过t检验检测群体间遗传多样性的差异显著程度并根据Nei公式计算遗传相似度和遗传距离分析群体间的遗传分化。结果表明,RAPD技术具有较高的灵敏性和多态性,是分析评估斜带石斑鱼遗传多样性较为适宜的分子标记之一;人工养殖不仅使斜带石斑鱼遗传多样性逐年下降,而且目前已经降低到显著的程度,近交和遗传漂变可能是导致遗传多样性下降的两个重要因素。文章最后还就保持斜带石斑鱼遗传多样性的养殖策略进行了探讨。
2)斜带石斑鱼养殖群体间的遗传多样性分析
对斜带石斑鱼惠州、深圳和湛江3个养殖群体进行了随机扩增多态DNA(RAPD)分析。统计多态位点百分率、基因多样性和香农信息指数等遗传参数,以此评估群体的遗传变异水平,并t检验群体遗传多样性的差异显著程度;根据Nei公式计算遗传相似度和遗传距离分析群体间的遗传分化,对遗传距离与地理距离的相关性进行Mantel检验。通过PCR扩增出线粒体细胞色素b(Cytb)基因,纯化后直接测序;统计变异位点、核苷酸多样性以及平均核苷酸差异数分析序列变异,根据非加权组平均法(UPGMA)和邻接法(NJ)构建系统树。结果表明:1)对研究斜带石斑鱼种内遗传变异,RAPD技术较线粒体Cytb基因序列分析具有更高的灵敏性和多态性;2)斜带石斑鱼的遗传多样性受过度捕捞和人工养殖的影响;3)斜带石斑鱼养殖群体间的遗传差异很小,具有相似的遗传背景。文章还从紧密性、保守性、碱基组成以及碱基偏倚等方面探讨了斜带石斑鱼线粒体Cytb基因的特点;针对目前斜带石斑鱼养殖模式,结合本研究结果提出了相应的保护该物种遗传多样性建议。
3)斜带石斑鱼和赤点石斑鱼的遗传多样性分析
对这两种石斑鱼进行了随机扩增多态DNA(RAPD)和线粒体细胞色素b(Cytb)基因序列变异分析。计算多态位点百分率、基因多样性和香农信息指数等遗传参数,以此评估种内遗传变异水平;通过统计变异位点、平均核苷酸差异数、核苷酸多样性以及种间平均每位点核苷酸替代数进行基因序列变异分析,并构建UPGMA系统树。结果表明:斜带石斑鱼的遗传多样性水平高于赤点石斑鱼,这可能与它们在种内特定遗传结构、分布范围大小、自然资源状况的差异有关;斜带石斑鱼和赤点石斑鱼之间检测到的种特异RAPD条带以及基因序列的变异,可作为种间分子鉴定标记。
二、石斑鱼类的分子系统进化研究
应用线粒体细胞色素b基因(Cytb)及两个核糖体RNA基因(16S和12S)序列对中国近海石斑鱼亚科3属13种进行种类鉴定及亲缘关系分析;结合GenBank上所有鮨科鱼类的同源序列,以真鲷和红带鲷为外群构建NJ系统树,对比形态系统学研究结果从亚科、族、属不同层面探讨石斑鱼类的分子系统进化。结果表明:1)线粒体基因序列在石斑鱼类种间存在较大的变异,种内变异极小,是进行石斑鱼类种类鉴定较为适宜的分子标记;2)所研究的3属13种石斑鱼类中,石斑鱼属与九棘鲈属的亲缘关系较近,与鳃棘鲈属的较远;3)赤点石斑鱼和青石斑鱼、蜂巢石斑鱼与鮭点石斑鱼、斜带石斑鱼与棕斑石斑鱼两两间具有较近的亲缘关系。4)鮨科的鮨亚科、花鮨亚科和石斑鱼亚科均为单系群,但研究未能证明石斑鱼亚科中5个族为单系起源,因此本研究支持了Johnson(1983)将鮨科划分为3亚科的形态学假设,Heemstra和Randall(1993)鮨科5亚科的划分值得商榷;5)在石斑鱼族中,鳃棘鲈属是最原始的种类,处于聚类群的最基部;九棘鲈属、侧牙鲈属和副花鮨属的进化地位也较为原始;以石斑鱼属为代表的六个属(石斑鱼属、偶鮨属、鳞鮨属、光腭鲈属、驼背鲈属和喙鮨属)处在系统树的顶端,是最近演化的种类,代表石斑鱼类系统发育的高峰;6)研究结果不支持鮨亚科为鮨科最原始的亚科、副鲈属为鮨亚科最原始的种类的传统形态系统研究得出的推论;花鮨亚科属种的分子数据很少,其系统进化有待进一步研究。