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木聚糖酶是广泛存在于自然界中的一种生物酶，其主要来源细菌、放线菌及真菌等微生物。木聚糖酶通过水解的方式作用于寡糖和多糖的糖苷键，使其降解为低聚木糖。木聚糖酶在造纸业、食品业、饲料工业及生物能源等领域有着广泛的应用。正是由于木聚糖酶所展现出的广阔工业应用前景，使得越来越多的科研人员投身于木聚糖酶的开发和研完工作。随着基因工程、蛋白质工程、生物信息学、酶学、晶体学和计算生物学技术的发展，不同酶学特征的木聚糖酶不断被发现。由于木聚糖酶反应条件的温和性和工业生产条件需要耐高温、耐酸碱的原因使得木聚糖酶在工业生产领域的应用困难重重。因此，要想使木聚糖酶在工业上发挥更大的效应，急需我们对木聚糖酶酶促反应机理进行更加深入的研究，并根据催化反应机理指导蛋白质改造，改善木聚糖酶在工业上的应用效果。
本论文以来源于里氏木霉的一种木聚糖酶作为研究对象，通过木聚糖酶基因克隆、原核细胞内表达、亲和层析和离子交换层析法纯化获得高质量的木聚糖酶的野生型和各种突变体。本文利用His标签与Ni柱特异性吸附的原理纯化木聚糖酶，创新性的使用两步Ni柱纯化的方法，获得目的蛋白。该方法缩短了传统纯化方法的时间，提高了纯化效率。本实验在木聚糖酶的N端增加了一段促溶蛋白Nusa，增加木聚糖酶在大肠杆菌中进行大量可溶性表达，减少了包涵体的形成。
本文将蛋白质晶体学当作一种手段应用于木聚糖酶催化机理的研究。通过悬滴法和坐滴法等蛋白质结晶方法获得高质量的蛋白质晶体。符合要求的晶体进行X光衍射获得体衍射图，通过晶体的衍射图计算出蛋白质分子的空间结构。该方法通过最直观的方式观察蛋白质分子内部空间结构的变化来研究木聚糖酶催化反应机理。与两个催化谷氨酸E86和E177直接形成H键的残基Y88和Y77对催化很重要，我们使用高分辨率X射线晶体学，理论pKa计算研究了这些重要残基的功能。我们的结果表明，这些保守的酪氨酸残基不仅改变了催化谷氨酸的pKa值，而且改变了活性位点中木糖的构象以促进催化。本研究获得的高分辨率X射线晶体的结果支持木聚糖酶水解过程中的-1住糖环能量行程1S3→4H3→4C1，这表明-1位糖环的灵活性对于断裂糖苷键非常重要。由于氨基酸残基N44靠近糖苷键断裂位置，本文猜测将N44突变为D44或者E44后，D44是否可以像E177一样作为质子供体甚至是否有可能在突变体N44D中形成偶联二羧酸系统提高酶活。但是通过突变体结构结合酶活力否定了这一猜测。
本文基于木聚糖酶野生型及其突变体晶体结构，对木聚糖酶活性中心相关氨基酸进行研究，完善了木聚糖酶酶促反应机理，为工业上更加高效的利用木聚糖酶提供理论基础。
本论文以来源于里氏木霉的一种木聚糖酶作为研究对象，通过木聚糖酶基因克隆、原核细胞内表达、亲和层析和离子交换层析法纯化获得高质量的木聚糖酶的野生型和各种突变体。本文利用His标签与Ni柱特异性吸附的原理纯化木聚糖酶，创新性的使用两步Ni柱纯化的方法，获得目的蛋白。该方法缩短了传统纯化方法的时间，提高了纯化效率。本实验在木聚糖酶的N端增加了一段促溶蛋白Nusa，增加木聚糖酶在大肠杆菌中进行大量可溶性表达，减少了包涵体的形成。
本文将蛋白质晶体学当作一种手段应用于木聚糖酶催化机理的研究。通过悬滴法和坐滴法等蛋白质结晶方法获得高质量的蛋白质晶体。符合要求的晶体进行X光衍射获得体衍射图，通过晶体的衍射图计算出蛋白质分子的空间结构。该方法通过最直观的方式观察蛋白质分子内部空间结构的变化来研究木聚糖酶催化反应机理。与两个催化谷氨酸E86和E177直接形成H键的残基Y88和Y77对催化很重要，我们使用高分辨率X射线晶体学，理论pKa计算研究了这些重要残基的功能。我们的结果表明，这些保守的酪氨酸残基不仅改变了催化谷氨酸的pKa值，而且改变了活性位点中木糖的构象以促进催化。本研究获得的高分辨率X射线晶体的结果支持木聚糖酶水解过程中的-1住糖环能量行程1S3→4H3→4C1，这表明-1位糖环的灵活性对于断裂糖苷键非常重要。由于氨基酸残基N44靠近糖苷键断裂位置，本文猜测将N44突变为D44或者E44后，D44是否可以像E177一样作为质子供体甚至是否有可能在突变体N44D中形成偶联二羧酸系统提高酶活。但是通过突变体结构结合酶活力否定了这一猜测。
本文基于木聚糖酶野生型及其突变体晶体结构，对木聚糖酶活性中心相关氨基酸进行研究，完善了木聚糖酶酶促反应机理，为工业上更加高效的利用木聚糖酶提供理论基础。