论文部分内容阅读
杂种优势育种已经在园艺作物中广泛应用，利用雄性不育系开展优势育种是一种重要的途径。但是目前有关雄性不育的研究存在一些不足，如有的作物难以获得雄性不育源、不育性不稳定、有的作物难以获得理想的恢复系，植物基因工程雄性不育系的创建和利用被作为最具前景的育种途径，成为当今世界范围内研究、开发和利用的热点。因此本研究利用基因工程方法把雄性不育基因转到模式植物番茄中，旨在利用双组分系统获得不育率为100％的核不育系。
本研究以黄樱桃番茄为试验材料，把Barnase不育基因变成Bn-5和Bn-3两个基因片段，构建好相应的植物表达载体，利用农杆菌介导法把表达载体转化到番茄中，对抗性植株进行了检测，并对转化植株的自交后代和杂交后代进行了育性调查。主要取得了以下研究结果：
1构建了两个植物表达载体
根据Barnase序列设计了两对特异引物，通过PCR扩增出Bn-5和Bn-3两条目的片段，他们的序列大约为310bp。随后把这两个片段连接到T-载体上，用BamHI和NcoI双酶切后回收小片段，再和回收到的载体片段连接转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单菌落提取质粒，用BamHI和NcoI双酶切检测，然后把构建好的表达载体pCABARTABn-5和pCABARTABn-3利用冻融法转到农杆菌中EHAI05中，保存，备遗传转化之用。
2优化了番茄遗传转化体系
通过选择压大小、预培养和共培养的时间、抗生素浓度等因素对番茄遗传转化影响的探讨，最终优化的番茄遗传转化体系为：种子经2％的次氯酸钠消毒12min后，播种于1/2MS培养基上获得无菌苗；切取7-10d苗龄的子叶作为外植体，在分化培养基MS+2.0mg/L6-BA+0.8mg/LIAA+1.Omg/LZT中预培养2d;浸入用MS液体培养基悬浮至0D600≈0.5的农杆菌工程菌液中侵染12min，无菌纸吸去残留菌液，重新接入分化培养基中暗培养2d:转接至含Cef400mg/L的抑菌培养基上，抑菌培养5-7d;
再接入含Cef400mg/L和Km30mg/L的抑菌筛选培养基中，两周继代一次，对获得的不定芽进行多代筛选，最后获得少数具Km抗性的绿色不定芽；将伸长至2-3cm高的不定芽切下，转到生根培养基上诱导生根，获得抗性小苗；待根粗壮后炼苗、移栽。
3抗性植株PCR检测及其花粉生活力鉴定
提取抗性植株的DNA，进行PCR扩增检测。获得的10株Bn-5抗性植株中全部扩增出目的带，PCR阳性率为100％：获得的11株Bn-3抗性植株中有10株扩增出目的带，1株没有扩增出目的带，PCR阳性率为90.9％。通过花粉TTC染色试验表明：所有Bn-5和Bn-3抗性植株的花粉染色率都在95％以上，花粉活力正常。从而初步表明目的基因已经整合到了黄樱桃番茄基因组中。
4转化植株自交后代和杂交F1的花粉生活力分析
转化植株自交和杂交后都能正常结果，并且果实没有差异，成熟后能够得到种子。通过花粉萌发和花粉TTC染色试验，结果表明：转化植株To5-1与T03-1自交后代的花粉萌发率和染色率都在92％以上，花粉活力正常；选取转化植株To5-1与T03-1的正反交F1进行花粉生活力的检测，70株F1植株中，有65株的花粉既不萌发，也没有染色现象，表现雄性不育，表明T05-1与T03-1通过杂交后，发生同源重组，Barnase雄性不育基因功能得到恢复。5株F1植株表现雄性可育。同时利用Barnase的特异引物，对70株F1进行PCR检测，所有65株表现雄性不育的植株都能够扩增出Barnase完整序列，而5株表现雄性可育的植株则不能扩增出Barnase完整序列。因此Barnase的重组率达到90％以上。