论文部分内容阅读
【目的】 甲状腺癌是内分泌系统常见的肿瘤之一，其中未分化甲状腺癌具有生长速度快、易发生转移、恶性程度高、预后差等特点，目前临床上尚无特别有效的药物针对该病进行治疗，因此，迫切需要找到有效治疗未分化甲状腺癌或者能改善其治疗效果的药物。本文着重研究硒-甲基硒代半胱氨酸(MSC)促进未分化甲状腺癌BHT101与8305C细胞凋亡的作用，并探讨其机制，初步构建了该药物诱导未分化甲状腺癌细胞凋亡的实验理论基础，为治疗未分化甲状腺癌提供了新思路。 【方法】 1、设置空白对照组和不同浓度的MSC实验组，浓度分别为25μM、50 μM、100 μM、150 μM、200 μM、400 μM。采用CCK-8方法检测不同浓度组MSC对未分化甲状腺癌细胞增殖抑制的影响，挑选有意义浓度组再进行后续研究。 2、设置空白组和不同浓度的MSC实验组，浓度分别为50 μM、100 μM、150 μM，运用流式细胞技术检测不同浓度组MSC对未分化甲状腺癌细胞周期、凋亡和线粒体膜电位的影响。 3、设置空白组和不同浓度的MSC实验组，浓度分别为50 μM、100 μM、150 μM，采用Hochest 33258染色检测MSC对未分化甲状腺癌细胞核形态变化的影响。 4、设置空白组和不同浓度的MSC实验组，浓度分别为50 μM、100 μM、150 μM，运用免疫印迹法检测凋亡相关蛋白的变化及展开分子机制研究。 5、采用DCHF-DA荧光探针检测未分化甲状腺癌细胞内ROS的变化。 【结果】 1、CKK-8实验结果表明MSC可以明显抑制未分化甲状腺癌细胞增殖，MSC在50 μM浓度组即可明显抑制细胞的生长；在25 μM浓度组第48 h和72 h也可明显抑制细胞生长，上述结果均呈剂量相关性。 2、流式细胞检测结果表明MSC能够诱导未分化甲状腺癌细胞出现周期阻滞，呈现一定的剂量相关性。在较高浓度的150μM组可以使G1期细胞数比例明显降低 (由62.616%降低为34.085%)，S期与G2/M期细胞数比例明显升高 (分别由24.871%和12.513%升高为43.037%和22.868%)，同时也观察到明显的亚二倍体凋亡峰 (subG1)出现，由50μM组的20%上升到150μM组的60%，呈剂量相关性。 3、Hoechst 33258染色结果表明，MSC诱导未分化甲状腺癌细胞出现核固缩，Annexin V-FITC/PI双染法进一步证实了50μM、100μM和150μM浓度组的MSC作用48 h后均能诱导细胞凋亡，BHT101细胞凋亡率由15.3%上升到42.2%，8305C细胞凋亡率由10.8%上升到30.7%，呈剂量相关性。 4、用western blot实验分别检测胞浆和线粒体中Cyt c的表达，显示MSC作用后线粒体中Cyt c的表达量降低，而胞浆中Cyt c的表达量升高，提示MSC诱导细胞凋亡与线粒体有关。同时也发现MSC作用后抗凋亡蛋白Bcl-2表达量降低，促凋亡蛋白Bax表达量升高，凋亡相关因子Active-Caspase3和Cleved-PARP的表达量升高，WB灰度值统计结果显示，Bcl-2/Bax比值随着MSC浓度的升高而降低，且呈一定的剂量相关性，表明MSC诱导细胞凋亡是caspase依赖性的。 5、PI3K/Akt信号通路检测显示MSC是通过抑制PI3K/Akt信号通路而发挥诱导细胞凋亡作用的。MSC能够抑制PI3K、Akt和mTOR的磷酸化，同时使其相应的原型表达升高，p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR的比值随着MSC浓度的升高而降低，上述结果均呈一定的剂量相关性，GS3Kβ的原型和活性形式GSK-3β(p-Tyr216)的表达升高，而其失活形式GSK-3β (p-Ser9) 水平降低，而Mcl-1的表达水平下降，MSC作用之后survivin的表达降低，Bad的原型升高而其磷酸化随着MSC浓度的升高而降低，表明MSC是通过调控PI3K/Akt信号通路来抑制癌细胞的生长并促进其凋亡。 6、采用DCHF-DA荧光探针检测到MSC能够诱导肿瘤细胞产生大量的ROS，ROS在细胞内将DCHF-DA氧化成带荧光的DCF，MSC处理后未分化甲状腺癌细胞内DCF明显升高，荧光强度随着MSC浓度的升高而增强，呈现一定的剂量相关性，表明MSC诱导的凋亡和ROS有着密切的关系。 【结论】 MSC能够明显抑制未分化甲状腺癌细胞BHT101与8305C的增殖，并使细胞出现周期阻滞，MSC诱导肿瘤细胞内产生大量的ROS，进而抑制PI3K/Akt信号通路，引起线粒体膜通透性增加、线粒体膜电位下降以及凋亡相关因子释放，从而诱发caspase级联反应，最终导致凋亡的发生。MSC能诱导未分化甲状腺癌细胞BHT101与8305C凋亡，有望成为治疗未分化甲状腺癌的药物之一，值得进一步深入研究，本文为未分化甲状腺癌的治疗提供了新思路。