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血栓疾病严重危害人类的生命与健康,纳豆激酶作为一种潜在的新型口服溶栓药物备受关注。分离纯化技术是限制其大规模生产的瓶颈问题。本文通过改进悬浮聚合法制备了磁性聚醋酸乙烯酯微球,经水解、氨基化修饰,以戊二醛作间隔臂偶联配基对氨基苯甲脒,制得磁性PVA亲和微球,并用于纳豆激酶粗酶液的分离纯化,通过SEM,XRD,FT-IR,VSM对所合成的微球进行了表征。研究了纳豆激酶的酶活稳定性、吸附平衡、吸附和解吸动力学、酶的纯度和酶活回收。研究内容主要包括以下三个方面:
(1)采用化学共沉淀法制备表面包覆油酸的磁性Fe3O4凝胶,采用悬浮聚合法合成了磁性聚醋酸乙烯酯(PVAc)微球,并考察了不同搅拌速率下,其形貌和粒径大小的不同。在800 r/min时,制备的磁性微球的平均粒径为3.3μm,产物具有超顺磁性。
(2)通过磁性聚醋酸乙烯酯微球醇解得到磁性聚乙烯醇微球,然后通过氯乙胺亲核取代使其表面氨基化,最后以戊二醛作为间隔臂接枝对氨基苯甲脒亲和配基,制得适合纳豆激酶分离的磁性亲和载体。其比饱和磁化强度为32.4 emu/g,具有超顺磁性,易于用外加磁场分离。采用在293 nm处测定接枝反应前后对氨基苯甲脒含量的变化来测定表面接枝亲和配基的量,计算得到磁性微球表面接枝配基含量为1.51mmol/g。
(3)使用固定化配基对氨基苯甲脒的亲和微球对纳豆激酶浸提液进行了纯化,每50 mg磁性亲和微球能分离纳豆激酶12.3 FU。微球表面偶联丰富的配基,吸附量明显增加。磁性微球具有较高的比饱和磁化强度,40 min即可达到吸附平衡。在1mol/L NaCl溶液中,15 min内完成解吸。酶活回收率为73.4%,纯化因子为10.3。纳豆激酶纯度经电泳分析为一明显条带,分子量为28 kDa。